PRDX3在姜黄素减轻布比卡因诱导的SH-SY5Y细胞凋亡中的作用及其机制研究

苏怀轩 樊友凌 江伟航 潘杰慈 黄政通

广州市番禺区中心医院麻醉科，广东广州 511400

布比卡因（bupivacaine）是一种氨基酰胺类的局部麻醉药[1]，常用于临床局部麻醉和止痛，但有报道显示布比卡因会引起神经细胞凋亡[2]，对神经系统产生毒性，导致神经元损伤，进而造成患者运动或感觉障碍，严重影响了患者生活。随着局麻药在临床手术中广泛的使用，其周围神经毒性逐渐引起人们的重视，其中以短暂神经综合征（transient neurologic syndrome，TNS）、马 尾 综 合 征（caude equina syndrom，CES）最为常见。局麻药神经损伤的防治成为临床麻醉中的重要课题。姜黄素是一种低分子量的多酚化合物[3]，是中药姜黄的主要活性成分，具有多方面的药理作用[4]。SH-SY5Y细胞是人神经母细胞瘤细胞，被广泛运用于构建神经细胞损伤模型，研究神经系统疾病的发病机制和预防治疗手段[5]。

抗氧化蛋白PRDX3属于硫氧还蛋白过氧化物酶家族[6]，位于线粒体基质，主要作用是清除线粒体内过氧化物，在细胞抗氧化防御体系及维持线粒体内环境稳态过程中发挥重要作用[7]。

本科研小组通过前期实验构建了布比卡因损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型[8]，发现姜黄素预处理12h能减轻布比卡因所致的SH-SY5Y细胞凋亡[9]，并通过细胞形态、细胞活力和凋亡率等指标的变化明确姜黄素的神经保护作用[10]，同时通过对线粒体途径介导的SH-SY5Y细胞凋亡的相关研究探讨抗氧化蛋白PRDX3的作用及其可能机制，发现PRDX3的高表达可能是导致这一保护作用的机制，为临床防治局麻药神经损伤提供了新的理论依据和方法。

1 资料与方法

1.1 仪器与材料

（1）仪器

FACSsort流式细胞仪（美国BD 公司），BX260型荧光显微镜、CK30 型倒置相差显微镜（日本Olympus 公司）；Sunrise RC+TW型遥控酶标分析仪（奥地利Tecan 公司）。

（2）细胞株

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞购自中国科学院上海细胞所。

（3）试剂和药品

姜黄素、布比卡因、MTT、Hoechst33258 荧光染料（美国sigma公司）；

1.2 方法

（1）SH-SY5Y细胞培养

SH-SY5Y细胞在含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基、5% CO2、37℃条件下培养。

（2）布比卡因损伤人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞模型的构建

体外培养SH-SY5Y细胞，设置布比卡因浓度梯度，分为 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mM 组，MTT 检测细胞活力，确定布比卡因对SH-SY5Y的损伤的IC50值，本实验中我们选择1.5mM布比卡因建立SHSY5Y细胞损伤模型。

（3）实验分组

将细胞按照条件不同分为四组：（1）空白对照组（con）：未经过处理的；（2）模型对照组：加入1.5mM 布比卡因孵育 24h（B）；（3）1μM 姜黄素预处理 12h（C）；（4） 1μM 姜黄素预处理 12h后，加入1.5MM布比卡因孵育24h（C+B）。

（4）MTT法测定细胞活力

取对数生长期的SH-SY5Y细胞，计数后细胞悬液按每孔100μL加入96 孔培养板。48h 后，在有或没有布比卡因的培养液中继续孵育4h，每孔加入MTT溶液（5g/L）20μL，再继续培养4h，小心吸出上清，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10min，使沉淀充分溶解，用酶标仪在570 nm波长处测定吸光度，计算细胞活力。

（5）流式细胞（FCM）检测各组SH-SY5Y 细胞凋亡率

流式细胞仪（FACSsort，美国Becton Dinkinson公司）检测，CellQuest 软件分析细胞凋亡率。

（6）Hoechst33258 荧光染料染色观察细胞核形态的改变

（7）逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测PRDX3 mRNA水平变化

采用Trizol一步法分别提取上述四组里SHSY5Y细胞的总RNA。结果观察：分别取5μL扩增产物加样至1.5%琼脂糖凝胶电泳，用GDS 凝胶图像成像系统拍摄结果。

（8）Western blot 检 测 PRDX3，Bax，Bcl-2，caspase-9等蛋白表达量变化

蛋白质提取，BCA法蛋白定量试剂盒测蛋白浓度，聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，抗体标记，曝光等。

1.3 统计学处理

2 实验结果

2.1 布比卡因抑制SH-SY5Y细胞活力和诱导细胞凋亡

体外培养SH-SY5Y细胞，分为六组，对照组未经药物处理，SH-SY5Y 与不同浓度（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5mM）的布比卡因一起培养24h，这五组记为 B0.5，B1.0，B1.5，B2.0，B2.5。MTT 检测结果显示布比卡因处理24h后，各个实验组中不同浓度的布比卡因对SH-SY5Y细胞活力均有影响，具有显著抑制作用，细胞活力的降低与布比卡因浓度的增加呈正相关。B0.5～B2.5组别细胞活力分别下降至85%，72%，50%，42%和24%（见图1）。检测及计算后得知，布比卡因诱导细胞死亡的IC50值为1.48mM，因此本实验选择布比卡因浓度为1.5mM建立神经细胞损伤模型，进行后续实验。

布比卡因处理24h后，经Hoechst33258 荧光染料染色，可见具有凋亡征象的细胞，细胞形态变圆、变小、收缩，胞核深染、固缩，细胞质也出现收缩现象。对照组正常细胞则细胞膜完整、光滑，细胞核正常。

实验结果经流式细胞术结果显示经过布比卡因处理后的细胞凋亡率显著提高，稀薄凋亡率和布比卡因的浓度呈正相关，空白对照组凋亡率为5.01%，B0.5～B2.5组别细胞凋亡率分别为19.22%，25.34%，38.18%，52.56%和65.17%，见表1。

因此，我们发现布比卡因对SH-SY5Y细胞有损伤作用，浓度升高，损伤程度加深。选择1.5mM浓度布比卡因建立细胞模型。

图1 布比卡因对SH-SY5Y细胞活力的抑制作用

表1 不同浓度布比卡因对SH-SY5Y细胞生长的影响（± s）

表1 不同浓度布比卡因对SH-SY5Y细胞生长的影响（± s）

布比卡因浓度（mM） n 凋亡细胞百分比（%）0 3 5.01±1.23 0.5 3 19.22±1.68 1.0 3 25.34±5.12 1.5 3 38.18±4.35 2.0 3 52.56±2.98 2.5 3 65.17±4.19 F 64.428 P 0.000

2.2 姜黄素减轻布比卡因对SH-SY5Y细胞活力的抑制和细胞凋亡率

体外培养SH-SY5Y细胞，分为如下几组：对照组Con（未经任何处理的细胞），B组（布比卡因浓度 1.5mM），B+C0.5，B+C1.0，B+C2.0，B+C5.0，B+C10.0（布比卡因处理细胞之前加入姜黄素预处理12h，姜黄素浓度分别为 0.5，1.0，2.0，5.0，10.0μM。姜黄素对各个实验组SH-SY5Y细胞活力均有影响（见表2）。其中低浓度组别1μM姜黄素明显减少了布比卡因导致的细胞活力降低，高浓度组别姜黄素对于神经细胞有毒害作用，无保护作用。确定姜黄素浓度为1μm作为后续试验浓度。

姜黄素预处理后的细胞凋亡率约为20%，而不加姜黄素的布比卡因损伤细胞的细胞凋亡率为30%（见表3）。以对照组细胞活力为100%，姜黄素处理的相对细胞活力约为89%，而布比卡因组细胞活力为71%，差异有统计学意义（P＜0.05）（见表2），根据细胞凋亡率和细胞活力数据的对比证明，姜黄素可以减轻布比卡因诱导的神经损伤。

2.3 姜黄素预处理后，PRDX3 mRNA转录水平上调

RT-PCR结果显示：与空白对照组相比，姜黄素预处理组（B+C）SH-SY5Y细胞PRDX3转录水平 略有下调，差异无统计学意义，而布比卡因单独处理组（C）PRDX3 mRNA水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图2）。

表2 不同浓度姜黄素对SH-SY5Y细胞活力的影响

表3 姜黄素对SH-SY5Y细胞凋亡的影响（± s）

表3 姜黄素对SH-SY5Y细胞凋亡的影响（± s）

布比卡因浓度（mM） （μM） n 凋亡细胞百分比（%）0 0 3 9.67±3.52姜黄素浓度1.5 0 3 34.51±5.55 1.5 1.0 3 19.54±6.98 0 1.0 3 12.67±4.33 F 18.246 P 0.000

图2

2.4 姜黄素预处理后，PRDX3蛋白质表达量增高

Western 印迹结果显示：与对照组（con）相比，姜黄素预处理组（B+C）SH-SY5Y细胞表达PRDX3略有减少，差异无统计学意义，而布比卡因单独处理组（C）PRDX3蛋白水平明显减少，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图3）。

图3

3 讨论

在本研究中，我们展示了姜黄素在布比卡因诱导的神经毒性中的保护作用。用1μM姜黄素预处理显著增加布比卡因处理的细胞中的PRDX3的蛋白表达量和Akt磷酸化。我们的研究结果表明，姜黄素通过PRDX3和Akt磷酸化水平依赖性机制减弱布比卡因诱导的神经元损伤[11]。姜黄素可能是临床上应用局麻药引起神经毒性的潜在神经保护剂。

人神经母细胞瘤细胞系（例如SH-SY5Y）与真正的神经元细胞不同，具有明显的肿瘤细胞特征。 因此，SH-SY5Y细胞被广泛用于研究局麻药的神经毒性[12-13]，因为它们可以模拟神经元的生物学特性。 因此，SH-SY5Y细胞被用于我们的神经元损伤的体外模型。 布比卡因浓度为1.5mM，等于0.045%，用于本研究[14]。虽然此浓度不在临床使用的浓度范围内，但1.5mM布比卡因能显著诱导神经元损伤，形态学变化和MTT测定结果已证明这一点[15]。我们的结果与之前的报道一致，布比卡因主要通过诱导坏死和凋亡来引发神经元细胞损伤[16]。

姜黄素已用于中医数千年，一般认为是安全的。在这项研究中，我们观察到当SH-SY5Y细胞用它预处理12h时，1μM（大约0.4mg/mL）的姜黄素没有任何细胞毒性并且阻止了布比卡因的毒性。当浓度增加到2，5，10μM时，我们发现姜黄素对布比卡因诱导的细胞损伤的神经保护作用减弱或甚至消失。数据表明姜黄素对布比卡因毒性的保护作用是剂量依赖性的，需要进一步的研究来确定姜黄素的细胞毒性作用的相对贡献。总之，我们的结果表明，低浓度的姜黄素预处理12h将有利于预防布比卡因诱导的神经毒性。

抗氧化蛋白PRDX3属于Peroxiredoxin抗氧化蛋白超家族，它是线粒体特有的过氧化物酶，在内质网合成后，转运至线粒体，依赖硫氧化蛋白还原过氧化物在线粒体基质内清除线粒体过氧化物，从而减少ROS产生。已有研究证明，线粒体内ROS的增加与局麻药布比卡因导致的神经损伤关系非常密切。我们的研究证明姜黄素能增强抗氧化蛋白PRDX3（Peroxiredoxin3）的表达。本实验中，姜黄素能够激活PRDX3表达，PRDX3表达水平增高后，细胞内过多的氧自由基分子被清除，布比卡因诱导的细胞凋亡减少。我们发现姜黄素的抗氧化应激作用通过增强PRDX3蛋白表达，从而发挥神经保护作用。

已知与正常细胞相比，凋亡细胞通常具有显着的线粒体膜电位去极化[17]。Dwm的丢失是线粒体相关的凋亡级联中的关键早期事件，其导致线粒体通透性的转变和细胞色素c和其他促细胞凋亡因子向胞质溶胶的释放[18-19]。因此，保持线粒体功能可以阻止线粒体依赖性细胞凋亡的激活。我们猜测Dwn可能参与姜黄素的神经保护作用，姜黄素可能减轻布比卡因诱导的Dwm损失。此外，Akt抑制可能消除了姜黄素对布比卡因诱导的Dwm损失的保护作用。

许多研究表明，Akt是PI3-激酶下游的关键激酶，在不同的细胞应激条件下神经元的存活和死亡途径中起着关键作用[20-22]。先前的报道显示布比卡因降低Akt的磷酸化水平并导致Na2细胞，人肾细胞和小鼠C2C12成肌细胞中的细胞损伤。相反，增加Akt的磷酸化水平可减弱布比卡因诱导的损伤[23]。在本研究中，我们观察到布比卡因降低Akt的磷酸化水平并导致细胞凋亡。这与以前的报道一致，即布比卡因诱导的人近端肾小管细胞凋亡与Akt活性的抑制有关[24]。我们观察到Akt活化的阻断降低了姜黄素对布比卡因挑战的细胞保护作用。总之，我们的研究结果表明，激活Akt信号传导介导了姜黄素对布比卡因诱导的神经元死亡的神经保护作用。总之，我们的研究结果表明用姜黄素预处理SH-SY5Y细胞对布比卡因诱导的神经毒性具有保护作用。

总而言之，这种细胞保护作用至少部分是通过增加PRDX3的蛋白表达量来介导的。如果我们从转化的神经母细胞瘤细胞的体外研究结果可以应用于体内的神经元，那么这项研究提示了临床工作者们将姜黄素作为潜在的治疗布比卡因诱导的神经毒性的药物的可能性。