抑制HIF-1ɑ对胰腺癌MIA-Paca2细胞辐射敏感性影响及相关机制研究

邵凌东 彭清琴 唐黎瑞 张雪清 李金銮 吴君心

福建医科大学附属肿瘤医院 福建省肿瘤医院放疗科，福建福州 350014

胰腺癌约占所有肿瘤发病率的3.2%；然而，由于其很高的死亡率，患病者中约有80.3%发生肿瘤相关死亡[1]，在欧美发达国家肿瘤相关死亡中高居第4位[1-2]。目前，临床上仅15% ～ 20%的确诊患者可进行手术切除治疗，这使得胰腺癌的总体生存率很难提高。而这部分手术可切除的患者，中位生存时间仅为 15～23个月[3-4]，5年总生存＜20%[4]。通过联合放射治疗与化疗提高胰腺癌的局部切除率、降低术后复发率并最终提高总生存率成为目前的研究热点。研究表明[5]，在HIF-1ɑ表达较高的腺癌细胞株PC-3中，使用HIF-1ɑ抑制剂YC-1，可明显下调HIF-1ɑ的表达，并进一步降低了血管内皮生长因子（VEGF）表达，从而抑制增殖和诱导凋亡。这也揭示了HIF-1ɑ/VEGF可以作为抗肿瘤治疗的重要靶点。目前国内外尚缺少在胰腺癌中使用HIF-1ɑ/VEGF抑制剂的放射增敏研究。在本实验中，通过HIF-1ɑ的抑制剂YC-1抑制HIF-1ɑ的表达进行体外实验，观察在辐射条件下胰腺癌MIA-Paca2细胞株的凋亡情况及对HIF-1ɑ和VEGF的表达水平的影响，为胰腺癌的放射增敏治疗提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料及设备

人胰腺癌MIA-PaCa2细胞株由中国科学院上海细胞库提供；YC-1购自英国Tocris公司；细胞凋亡试剂盒AnnexinV/PI来自美国BD公司；鼠抗人HIF-1ɑ单克隆抗体（H1alpha67）、鼠抗人VEGF单克隆抗体（VG1）购于美国Novus公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组 人胰腺癌MIA PaCa-2细胞选用含10%胎牛血清（PANSera ES FBS）的DMEM高糖培养液，在含5%CO2（体积分数），20%O2的37℃培养箱内培养。待培养细胞至对数生长期后进行分组，分为对照组和实验组。（1）空白对照组：加入生理盐水5μL；（2）YC-1 组：加入浓度为 0.1μmol/μL 的 YC-1 5μL（终浓度 10ng/mL）；（3）辐射（RT）组：60Co-γ 射线 2Gy，单次照射；（4）YC-1+RT组：加入5μL YC-1作用24h后给予60Co-γ射线2Gy单次照射。

1.2.2 AnnexinV/PI染色观察细胞凋亡 将处理后24h的MIA-PaCa2细胞调整至浓度为106个/mL，从中收集200μL。离心重悬后，加入Annexin-V-FITC。在每组细胞中加入PI后2min迅速检测。同时以不加Annexin V-FITC及PI的一管作为阴性对照。

1.2.3 Western Blot法检测MIA-PaCa2细胞HIF-1ɑ、VEGF的表达量 干预处理24h后收集各组细胞，使用蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂）提取总蛋白，采用BCA法检测蛋白浓度。取30～50μg的蛋白样品，随后进行SDSPAGE电泳分离，转移到PVDF膜上，进行封闭；加入一抗H1alpha67（1：1000），VG1（1：1000），4 ℃ 过 夜；加入二抗后室温孵育1～2h，TBST洗涤。使用ECL底物化学进行发光显色，通过Bio-rad化学发光成像系统进行曝光分析。实验均重复3次。

1.3 统计学处理

采用统计学软件SPSS22.0对数据进行统计分析，计量资料以（±s）表示，采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同处理方法对MIA-PaCa2细胞凋亡的影响

经检测，RT组、YC-1组及联合治疗组的细胞凋亡率均高于空白对照组；而通过RT组诱导凋亡的效果强于YC-1组，但结果差异无统计学意义（P＞0.05），联合治疗组的凋亡率明显高于其它处理组（P＜0.05）（见图1）。

图1 不同处理方法对MIA-PaCa2细胞凋亡的影响

2.2 不同方法处理后对MIA PaCa-2细胞HIF-1ɑ及VEGF蛋白表达量的影响

经过24h后，YC-1组HIF-1ɑ的表达降低，RT组HIF-1ɑ的表达高于YC-1组，且稍高于空白对照组。相较于空白组，YC-1组及单纯RT组，YC-1+RT联合治疗组中HIF-1ɑ的表达降低。

单独放疗组中VEGF蛋白的表达高于空白对照组及YC-1组，同时YC-1组中，VEGF表达较空白对照组低。在YC-1及RT联合治疗组中，VEGF的表达低于RT组，并稍高于YC-1组及空白对照组（见图 2）。

图2 不同干预方式对MIA PaCa-2细胞HIF-1ɑ及VEGF蛋白表达量的影响

3 讨论

HIF-1ɑ是HIF-1的活性亚基和调节亚基，在机体低氧适应和病理反应中起重要作用，是关键的氧调节亚基。研究发现在胰腺癌细胞中，HIF-1ɑ的含量与细胞的恶性生物学行为存在正相关[6-7]。Shibaji T等[7]针对胰腺癌的研究发现，HIF-1ɑ与肿瘤转移、VEGF 表达及间质微血管密度（IMD）相关，可以用来评估预后。在已知的血管生成蛋白中，VEGF是作用最直接的可溶性促内皮细胞分裂素，同时也支持着血管内皮细胞的存活。国内外研究发，VEGF通过多种作用机制促进肿瘤血管生成并增强血液流通以持续供给肿瘤组织养分与氧气[8]。在肿瘤乏氧的微环境中，HIF-1ɑ可上调VEFG表达，促进肿瘤血管生成。目前，拮抗VEGF的表达，降低其对微血管辐射损伤的保护，成为逆转辐射抵抗的重要策略。

本研究中，选择低表达HIF-1ɑ的胰腺癌细胞菌株MIA-PaCa2，通过辐射可上调HIF-1ɑ的表达。肿瘤微环境在电离辐射作用下产生乏氧条件，而在乏氧环境下HIF-1ɑ可稳定表达[9]。在肿瘤乏氧调节中，HIF-1ɑ具有中枢纽带地位，其高表达与辐射抵抗相关[10]。通过检测MIA-PaCa2细胞的凋亡情况可知，使用HIF-1ɑ抑制剂后，电离辐射引起的细胞凋亡及死亡率相较于未使用抑制剂组高。电离辐射通过直接或间接的方式损伤肿瘤细胞DNA，从而杀灭肿瘤细胞，然而，辐射可促进HIF-1ɑ的表达，提高肿瘤细胞的辐射抗性[11-12]。通过利用YC-1下调HIF-1ɑ的表达，能够降低肿瘤细胞的辐射抵抗，并促进肿瘤细胞的凋亡及死亡。Akakura N等[6]研究者对20种人胰腺癌细胞株进行了实验，发现其中75%人胰腺癌细胞株稳定表达HIF-1ɑ，且HIF-1ɑ在胰腺癌细胞抵抗乏氧和低糖诱导的凋亡中发挥重要作用。通过转染 HIF-1ɑ也可以提高对凋亡的抵抗及增加体内的肿瘤生成，这与我们的研究结果相符。

在肿瘤乏氧的微环境中，HIF-1ɑ可上调VEGF表达，VEGF通过参与内皮细胞增殖、分裂和迁移过程并促进肿瘤血管生成[13-15]。Itakura J等[16]在人胰腺癌组织及胰腺癌细胞株中检测VEGF的表达，证实胰腺癌细胞具有过表达 VEGF及其受体的能力，并发现其可以通过丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径促进胰腺癌生长主。本研究发现通过抑制HIF-1ɑ的表达，能够使得VEGF的表达降低。经过辐射处理后的胰腺癌细胞VEGF表达上调。辐射也可通过上调HIF-1ɑ的表达，进而影响下游蛋白VEGF。在肿瘤的生长、侵袭和转移过程中，VEGF都起着至关重要的作用，VEGF将是一个潜在的肿瘤治疗靶点[15]。通过抑制HIF-1ɑ表达，可间接影响VEGF蛋白。在使用HIF-1ɑ抑制剂后进行辐射处理，MIA-PaCa2细胞VEGF的表达较直接辐射低。由此可见，使用HIF-1ɑ抑制剂可以逆转辐射上调VEGF引起的辐射抵抗。

Zhao Q 等[5]研究者针对乏氧环境下下人胰腺癌细胞株PC-3进行了研究，发现其高表达HIF-1ɑ；通过利用HIF-1ɑ抑制剂YC-1，可明显下调其表达，并进一步降低了VEGF表达，从而诱导胰腺癌细胞的凋亡并抑制其进一步增殖。前期体内外实验研究证实，降低食管癌细胞中HIF-1ɑ及VEGF的表达可以提高辐射敏感性[17-18]。同时在一些恶性肿瘤患者中，HIF-1ɑ及VEGF与肿瘤患者的预后相关[19]，HIF-1ɑ还是抗表皮生长因子受体（EGFR）治疗的预后指标[20]。不管是在体内还是体外，亦或是在人体组织中，关于胰腺癌HIF-1ɑ及VEGF与电离辐射相结合的研究相对较少。本研究在常氧条件下利用低表达HIF-1ɑ的胰腺癌细胞菌株MIA-PaCa2及电离辐射，验证了电离辐射可以上调HIF-1ɑ及VEGF的表达。同时，抑制HIF-1ɑ可以提高辐射敏感性。

综上所述，本研究通过观察辐射与HIF-1ɑ抑制剂YC-1联合应用对胰腺癌MIA-PaCa2细胞凋亡的影响及HIF-1ɑ、VEGF蛋白的表达情况，结果显示电离辐射可促进HIF-1ɑ及VEGF蛋白表达；予YC-1处理后进行辐射处理，可逆转辐射对HIF-1ɑ及VEGF的上调作用。YC-1联合电离辐射能协同促进胰腺癌MIA-Paca2细胞凋亡， 其机制可能是通过抑制HIF-1ɑ，使VEGF表达下调，降低其对辐射损伤的保护作用，同时能够诱导胰腺癌细胞的凋亡，提高放射敏感性。