时差成像系统挑选优质胚胎对IVF-ET妊娠结局的改善作用

梁泳娜 梁见弟 陈燕锋 刘志刚

广东省东莞市人民医院生殖医学科，广东东莞 523018

世界卫生组织调查显示，全世界发达国家约8%～15%的夫妇受不孕症困扰，一些发展中国家的不孕症发生率甚至可达35%以上，且不孕症发生率呈逐年上升趋势[1]。体外授精-胚胎移植（IVFET）是常用的辅助生殖技术，通过促排卵和体外受精可获得多个胚胎，优质胚胎的选择不仅对妊娠率的提高有着很大帮助，也能改善妊娠结局。时差成像系统（time-lapse imaging，TLI）作为非侵入胚胎评估系统，评估过程不影响胚胎的发育，并能获得连续的胚胎动力学参数，从而准确评估其发育潜能[2]。目前国内在胚胎形态动力学尚未建立一个较为科学的评估体系用于挑选最具妊娠潜力的胚胎，本研究将TLI技术应用于IVF-ET中，观察其临床应用价值。对于TLI采用的WOW（well-of-the-well）集簇培养方式是否对胚胎发育潜能有影响，结局是否优于传统培养方法，国内鲜少有报道。本研究比较两种培养方法的胚胎发育情况，为TLI技术的安全性寻求依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

分析在东莞市人民医院生殖中心2015年8月～2017年5月接受IVF-ET治疗的不孕症患者98例。随机分组，实验组（A组）为47例常规IVF治疗患者，所有胚胎经TLI选择并移植。同期51例常规IVF治疗患者采用传统培养方法，并在Day3经形态学标准挑选胚胎进行移植为对照组（B组）。两组患者资料与受精情况类似，具有可比性（表1）。同期另选取共478枚胚胎，同一患者胚胎随机分为两组，一组采用TLI集簇培养（C组），另一组采用微滴单胚胎常规方法培养（D组）。纳入标准：女方年龄＜40岁；常规IVF周期；周期数＜2；获取卵子数6～16枚；常规长方案促排卵；卵泡刺激素（FSH）≤12IU/L。排除子宫内膜疾病或其他生殖器官疾病者；男性因素所致不孕者；先天性疾病者和全胚冷冻者。

1.2 方法

1.2.1 时差成像系统 本研究使用Primo Vision（Vitrolife）时差成像系统，图像采集频率为7min/次，每小时进行一次7个等焦距平面扫描，连续培养6d。培养采用9孔WOW培养皿，各孔均有位置标记。

1.2.2 胚胎培养 全部患者采用本中心常规促排方案，注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）后36h行卵泡穿刺术，将获得卵冠丘复合物（OCCC）放于G-IVF plus（Vitrolife）等待受精，受精时间为注射hCG 39h。受精6h后去除颗粒细胞，A组和C组胚胎移入WOW9孔培养皿，培养液滴为70μL经（37℃ 6% CO2，5% O2）平衡过夜的 G-1 plus。根据胚胎发育的动力学参数与卵裂模式选择D3胚胎移植，剩余胚胎继续置于平衡过夜的G-2 plus培养至D6结束。B组和D组胚胎移入含25μL G-1 plus微滴中进行单胚胎常规培养。

1.2.3 胚胎发育时间参数与妊娠判定 时间参数：将IVF受精时间记为”0”点，原核消失时间（tPNF），发育至2细胞时间为t2，发育至3细胞时间为t3，以此类推为t4、t5。2细胞发育至3细胞持续时间为cc2，3细胞发育至4细胞同步时间为s2。各时间点的命名方法参照Ciray[3]标准。依据伊斯坦布尔共识，卵裂期胚胎评估参考Peter[4]标准，囊胚期胚胎评估参考Gardner[5]标准。优质胚胎：细胞数7 ～ 9个，碎片＜10%，大小均一；Day3可利用胚胎：细胞数≥6个，碎片＜25%，大小均一。优质囊胚：内细胞团和滋养层细胞不含C。妊娠判定：D3移植2枚胚胎，2周后检测血hCG，6周进行B超检查，可见孕囊或胎心搏动即为临床妊娠。

1.3 观察指标

分析比较实验组（A组）与对照组（B组）的D3优质胚胎率、临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率的差异。采用Analyzer图像分析软件比较实验组（A组）种植胚胎与未种植胚胎的tPNF，t2，t3，t4，t5，cc2，s2。比较C组与D组的来源于2PN的胚胎的卵裂率、D3优质胚胎率、D3可利用胚胎率、囊胚形成率、优质囊胚率的差异。

1.4 统计学分析

采用SPSS20.0软件处理本研究所有数据，计量资料以（±s）表示，采用t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 两组患者一般资料比较（± s）

表1 两组患者一般资料比较（± s）

注：P均＞0.05

组别 女方年龄（岁） BMI（kg/m2） 基础FSH（IU/L） 平均获卵数 平均移植胚胎数A组 31.2±4.3 22.42±2.38 7.2±1.8 11.7±6.7 1.95±0.46 B组 31.1±4.8 22.68±3.02 7.3±1.9 12.3±7.6 1.92±0.45

表2 两组患者妊娠结局比较[%（n/n）]

表3 时间参数与胚胎发育潜能的关系分析（± s）

表3 时间参数与胚胎发育潜能的关系分析（± s）

组别 n tPNF t2 t3 t4 t5 cc2 s2种植胚胎 33 23.25±2.9 24.02±0.21 33.68±2.58 35.24±2.69 47.32±5.47 9.58±2.01 0.81±0.14未种植胚胎 45 25.38±2.27 26.41±2.08 34.21±2.41 36.84±4.14 48.89±5.36 12.36±3.17 3.52±4.08 t 3.652 6.564 0.931 1.938 0.347 4.423 3.807 P 0.013 0.006 0.354 0.056 0.729 0.021 0.009

表4 胚胎TLI集簇培养与常规培养结果比较[%（n/n）]

2 结果

2.1 两组患者妊娠结局比较

A组与B组的临床妊娠率、胚胎种植率、优质胚胎率、早期流产率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.2 时间参数与胚胎发育潜能的关系

A组种植胚胎与未种植胚胎相比，tPNF、t2、cc2、s2=t4-t3，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），t3、t4、t5差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3。

2.3 不同培养方式对胚胎发育潜能的影响

C组与D组的来源于2PN胚胎的卵裂率、D3优质胚胎率、D3可利用胚胎率、囊胚形成率、优质囊胚率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表4。

3 讨论

有研究[6]显示，胚胎在某一时间点的形态及发育状态与其发育潜能密切相关。临床大多采用形态评分系统对胚胎潜能进行评估，但是胚胎在移植前的发育是动态的，伴随胚胎的卵裂，其形态会不断变化。若未进行动态观察，则难以获取精确的卵裂参数。通过胚胎多次移出培养箱虽然能获取更多发育信息，但频繁改变胚胎培养环境，不利于胚胎发育。TLI作为非侵入胚胎评估系统，克服了传统胚胎评分中存在的缺陷，可通过观察胚胎受精至移植时的连续动态分裂图像，以及更多的胚胎质量筛选指标，从而提高临床妊娠率[7]。

现已证明，TLI主要以前3次卵裂时间及卵裂同步性来判断胚胎的质量[8]。本研究显示，种植胚胎与未种植胚胎的tPNF、t2、cc2、s2差异有统计学意义（P＜0.05），与相关文献报道结果相符[9]。说明时间动力学参数可作为胚胎筛选的主要指标。也有学者认为[10]，单凭时间参数进行胚胎挑选会降低准确性。同时应结合胚胎发育前期的卵裂模式和不良事件（碎片、不均卵裂、多核、混合型、非二倍性卵裂、发育停滞、卵裂球融合等）去挑选胚胎，可有效排除静态评估中判断为正常卵裂的异常卵裂胚胎[11]。2个胚胎在形态学相似情况下，通过TLI可观察到不同的发育过程，为临床选择优质胚胎提供参考依据，有助于改善临床妊娠率[12]。在本研究中，A组临床妊娠率、胚胎种植率、优质胚胎率较B组有一定的提高，可能与应用TLI排除了一些前期不良胚胎发育事件有关，但是两组差异无统计学意义，说明常规胚胎评分同样具有一定的科学性和有效性，也可能与本研究例数较少有关，需要更多研究进一步探讨TLI对IVF-ET妊娠结局的影响。有研究表明[13]，通过卵裂模式对胚胎进行筛选，可以降低早期流产率，也与本实验结果相符：实验组的早期流产率明显降低（3.33%vs15.38%）。

尽管TLI与传统培养相比有着很多优势，然而TLI的安全性也受到广泛关注。作为一种新的医疗技术，此系统与传统观察方法不同的是摄像观察的次数与光源。长期高频率每隔7分钟一次的拍摄曝光，550nm波长的短波可见光（200～700nm）可能对胚胎发育有害。也有学者认为[14]，总光源暴露的量远远低于倒置显微镜的光线辐射：primo vision曝光时间为100ms，以每隔7min拍摄一次计算，每枚胚胎在连续3d的培养中可获得617张图像，总的曝光时间为61.7s，仅相当于传统曝光时间的1/3。传统的观察方法在3d的观察中，胚胎暴露在倒置显微镜光源的时间总计平均为2～3min。时差系统光源为低强度LED，光强度是传统显微镜光源的1/20，550nm波长避开了抑制胚胎发育光谱范围，而传统倒置显微镜光源有15%的光谱在550nm以下。在本实验中，实验组（A组）与对照组（B组）的优质胚胎率、临床妊娠率、胚胎种植率、早期流产率差异均无统计学意义（P＞0.05）；另外，为了减少不同周期中患者个体差异，设计同一周期随机分成两组（C组和D组），比较TLI的安全性。只选来源于2PN胚胎，其卵裂率、优质胚胎率、Day3可利用胚胎率、 囊胚形成率、优质囊胚率差异均无统计学意义，但C组数据均略高于D组，可能与TLI集簇培养有关。时差成像系统采用WOW集簇培养法，既实现了对每个胚胎的追踪，独立监测，又可以让9个胚胎共享更大体积的培养液。有研究[15]证实，体外培养的胚胎具旁分泌和自分泌效应，这些生长因子相互作用带来更好的互利培养环境。因而集簇培养能令每个胚胎获得更佳的发育质量，更利于囊胚形成。本实验结果与相关研究报道结果相符[16]，提示TLI系统是安全可靠的，可以放心使用。

综上所述，TLI时差成像系统能够动态观察胚胎发育情况，通过时间参数与卵裂模式可判断胚胎发育潜能，为临床挑选优质胚胎提供参考，有利于改善临床妊娠结局。