特异性抑制内向整流性钾电流对缺血再灌注心脏的保护作用

黄芸，翁俊美，孟一迪，徐秋梅，聂大安，李子进，刘杰，李景东，姚东晓

(华中科技大学同济医学院附属协和医院：1老年病科，2心血管内科，3神经外科，武汉 430022)

冠心病心肌缺血和急性心肌梗死可导致心脏重构、心力衰竭和心律失常[1,2]。心肌再灌注治疗是最有效的治疗方法之一，但有导致再灌注损伤的不利作用[3,4]。缺血预适应可通过再灌注损伤补救激酶激活等机制，减轻心肌再灌注损伤[5,6]。内向性整流性钾电流(inward rectifier potassium current，IK1)在心肌缺血时下调，并在心肌细胞缺血预适应模型中起着重要作用[7,8]。长期以来，因无特异性的心脏IK1抑制剂，对其下调与缺血预适应和再灌注损伤的关系尚未阐明。为此，本研究选用转基因抑制心脏IK1小鼠，建立心脏缺血预适应模型，研究特异性抑制心脏IK1在缺血预适应时是否具有减轻再灌注损伤的作用及其机制，可望为开发新一代特异性心脏IK1抑制手段治疗冠心病心肌缺血提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与液体配制

转基因心脏IK1抑制小鼠(Kir2.1-AAA)由美国Michigan大学Anatoli N. Lopatin赠送，小鼠饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心SPF级(无特定病原体级实验动物，Specific Pathogen Free)环境中。Kir2.1-AAA转基因鉴定引物序列：正向为5′-CTGTGTCGACATCCGCTGGAGGTGG-3，反向为5′-CCCACTCTCCACATCAAGCAGAGTT-3′，其聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)产物为420 bp，将此条带测序，阳性者为GYG突变为AAA。实验取3～6个月龄小鼠，体质量18～25 g，分为观察组(n=9)和对照组(n=12)，雌雄比例相同。

Langendorff离体心脏灌流液：KHB(Krebs-Henseleit bicarbonate)溶液配制1 L需要氯化钠6.89 g、氯化钾0.35 g、碳酸氢钠2.1 g、硫酸镁0.144 g、磷酸二氢钾0.144 g、氯化钙0.368 g、乙二胺四乙酸钠(EDTA Na)0.416 g、葡萄糖2.702 g、丙酮酸盐2.703 g，浓盐酸调整pH=7.35。1%氯代三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)磷酸缓冲液：每100 ml含1 g TTC、88 mmol/L Na2HPO4和1.8 mmol/L NaH2PO4，pH=7.8。

1.2 方法

1.2.1 体表心电图 麻醉小鼠后，以温控小电热毯保持其体温在36℃～37℃，利用RM6240数据采集分析系统(成都仪器公司)持续记录基础状态下小鼠心电图5 min，测量心率(heart rate，HR)、PR间期和QRS间期，并监测心律失常发生情况。

1.2.2 心脏缺血预适应模型的建立 用1%戊苯巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，从主动脉远端分离心脏并连接至Langendroff灌流装置，以95%O2和5%CO2的混合气体持续冲入(37.0±0.5)℃的KHB液，先稳定10 min，缺血2 min，灌注5 min，2个循环，然后全心缺血20 min，再灌注45 min。实验结束后，取心脏-80℃保存。

1.2.3 心律失常检测 将3个Ag+/AgCl电极分别置于心脏心尖部和左右两侧形成 Einthoven三角，记录离体心脏心电图。心律失常评分标准为：无心律失常(0分)，房早或室早(1分)，室上速或成对室性早搏或T波电交替(2分)，室早呈三联率或呈短阵≥3个但≤10个(3分)，持续室速(定义为室早≥10个)或多行性室速或尖端扭转性室速(4分)[9]。

1.2.4 心肌梗死面积测定 取冷冻心脏，横切成约2 mm薄片5层，置入1% TTC磷酸缓冲液(pH 7.4)中37℃孵育20 min。梗死区呈灰白色，非梗死区呈深红色。拍照后，以ImageJ2x软件测定心肌梗死面积。

1.2.5 Tunel凋亡检测 灌流结束后将心脏置入4%的甲醛磷酸盐缓冲液，固定48 h，石蜡包埋心脏组织，切片，采用Roche的Insitucell death定量药盒检测。凋亡指数(‰)=凋亡心肌细胞核数/正常心肌细胞核数×1000‰。

1.2.6 Western blotting 取心脏左心室，检测样本浓度，15 μg/孔上样，SDS-PAGE电泳后转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶封闭，Ⅰ抗的稀释度为1∶1000，4℃孵育过夜。相应Ⅱ抗室温孵育2 h后，暗室曝光。蛋白条带相对浓度用Lab Image软件测定。Ⅱ抗包括p-AKT、AKT、p-GSK3β和GSK3β。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 转基因阳性小鼠鉴定及基因检测结果

Kir2.1-AAA转基因阳性与阴性PCR片段均显示420 bp条带(图1A)。阴性者显示KCNJ2孔道区为GGCTATGGT(编码相应氨基酸为GYG)，阳性为GCCGCTGCT(AAA)，见图1B。

2.2 基础状态下2组小鼠的体表心电图

基础状态下观察组(n=9)和对照组(n=12)的HR分别为(446.4±35.9)和(463.6±46.8)次/min，PR间期分别为(53.58±12.32)和(52.15±13.23)ms，QRS间期分别为(22.95±17.33)和(21.5±16.67)ms，2组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

图1 PCR检测结果

2.3 Kir2.1-AAA对小鼠心律失常的影响

与对照组(n=12)相比，观察组(n=9)心律失常评分分值显著降低[(3.50±0.67)vs(7.42±0.70)分，P<0.01]，提示抑制 IK1可减少缺血致心律失常的发生。

2.4 Kir2.1-AAA对小鼠心肌梗死面积的影响

与对照组(n=10)相比，观察组(n=8)小鼠心肌梗死面积/左室面积的比值显著减少[(0.25±0.04)%vs(0.38±0.02)%，P<0.05]。

2.5 Kir2.1-AAA对小鼠心肌细胞凋亡的影响

与对照组(n=7)相比，观察组(n=8)小鼠心肌细胞凋亡指数显著降低[(202±93)‰vs(822.5±97.5)‰，P<0.001]，提示特异性抑制IK1具有减缓心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞凋亡的作用。

2.6 Kir2.1-AAA对再灌注损伤补救激酶信号通路关键分子蛋白表达的影响

GSK3相对表达量在观察组和对照组中分别为(0.79±0.11)和(0.77±0.15)，2组间差异无统计学意义(P>0.05)，但观察组磷酸化糖原合成酶激酶3(phosphorylated glycogensynthaseldnase 3，p-GSK3)相对表达量显著高于对照组[(1.41±0.16vs(0.77±0.05)，P<0.05]，提示p-GSK3可能介导了Kir2.1-AAA对缺血再灌注心脏的保护作用(图2A)。此外，观察组中无论是AKT[(1.84±0.20)vs(0.81±0.14)]还是P-AKT[(1.87±0.27)vs(1.08±0.22)]的表达均显著高于对照组(P<0.01)，提示AKT和P-AKT均可能介导了抑制IK1对缺血再灌注心脏的保护作用(图2B)。

图2 Kir2.1-AAA对RISK信号通路关键分子蛋白表达的影响

3 讨 论

冠心病及其并发症严重威胁着人类的生命与健康[2]，IK1在冠心病心力衰竭时下调，在心脏重构过程中起着重要作用[10,11]。近年来，随着溶栓和介入技术的广泛应用，心肌缺血再灌注损伤越来越受到关注，缺血预适应可改善心肌缺血再灌注损伤，但其机制尚待深入研究[6]。本研究采用转基因特异性抑制IK1小鼠建立缺血预适应模型，结果发现特异性抑制IK1可以改善缺血预适应对缺血再灌注损伤的保护作用，减少心律失常发生以及心肌细胞凋亡和心肌梗死面积。

本研究结果表明，IK1抑制小鼠在离体心脏缺血再灌注模型缺血预适应后，其心律失常明显少于对照组小鼠。理论上讲，特异性抑制IK1既可能抑制也可能促进心律失常的发生，因为抑制IK1会降低静息膜电位的稳定性，促进除极化，使自律性增加[12]。但抑制IK1又可均一地延长动作电位时间和不应期，降低心室复极离散度而防止折返形成，延缓异常兴奋的传播，从而具有抗心律失常作用[13]。高血压性心肌肥大、心肌病及各种原因所致的心力衰竭均伴有IK1下调[14]，过度表达IK1的小鼠表现为心律失常及心脏肥大等异常[15]。本研究结果也证实了均一特异性抑制IK1具有抗心律失常的作用。

本研究表明，转基因抑制IK1可减少心肌梗死面积和心肌细胞凋亡。研究表明，缺血预适应会引起再灌注损伤补救激酶的激活，包括PI3K/Akt/GSK3β和Erk1/2通路的活化，再进一步激活或抑制下游信号分子包括酶代谢、凋亡分子等，抑制有害的线粒体膜通透性转换，从而保护心肌[16]。本研究结果显示，Akt蛋白与GSK3β蛋白在观察组(IK1抑制)的表达量高于对照组，提示抑制IK1可能加大激活这些信号传导的级联反应。值得提出的是，在文献[17]报道的与本研究相同的模型中，缺血预适应对野生型小鼠(本研究中的对照组)心脏本身即具有保护作用，因而本研究发现的特异性抑制IK1带来的有益作用至少部分是额外的协同作用。

综上所述，本研究结果证实特异性抑制IK1可保护缺血心脏。在离体心脏缺血再灌注模型缺血预适应后，转基因特异性抑制IK1小鼠相比野生型小鼠在抗心律失常方面具有明显优势，并且可减少心肌梗死范围、抗细胞凋亡，但对其具体分子机制还有待进一步研究。本研究可望为未来治疗缺血性心脏病提供新的理论依据。