DMB促进骨髓间充质干细胞 向成骨细胞分化并缓解小鼠卵巢切除导致的骨质疏松

孙梦寒，王 宁

(1.兰陵县中医院 外科, 山东 临沂 276000； 2.空军军医大学 药理教研室, 陕西 西安 710032)

胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1) 是由肠道L细胞分泌的一种具有30个氨基酸的肠道激素[1-2]。GLP-1通过和细胞膜上的G蛋白偶联受体结合发挥作用[3-4]。GLP-1临床上用于治疗2型糖尿病，同时具有保护神经和促进骨形成的作用[1,5-6]。但是在体内，GLP-1可以被二肽基肽酶Ⅳ降解，半衰期只有1 min，所以寻找GLP-1R长效激动剂是目前的主要工作。目前，临床上使用艾塞那肽(exendin-4)作为GLP-1R激动剂用于降低血糖水平[7]。不仅如此，有研究证实，exendin-4可以降低脑缺血再灌注对于神经元的损伤[8]，并对老龄性和失重导致的骨质疏松都具有保护作用[9-10]。但是长期使用exendin-4会使患者产生免疫反应。

最近报道,喹喔啉和环丁烷的取代衍生物可作为非蛋白类GLP-1受体激动剂的载体[11]。其中DMB(quinoxaline 6,7-dichloro-2-methylsulfonyl-3-N-tert-butylaminoquinoxaline)是GLP-1受体激动剂的喹喔啉的变构化合物。DMB能够增加对GLP-1R的亲和力，从而激活cAMP，活化GLP-1R信号通路。然而，有关DMB对于骨形成的作用的报道较少。本研究通过给予去除卵巢(ovariectomized, OVX)小鼠DMB治疗，探索DMB可否促进骨形成的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物：SPF级8周龄C57BL/6雌鼠30只[第四军医大学动物中心,合证号：scxk(军)2012-0007]，小鼠随机分为正常对照组、OVX组、OVX+DMB组。

1.1.2 试剂：H-DMEM(HyClone公司)；DMB(Nottingham公司); FBS(Gibco公司)；兔抗鼠CD29、Sca-1、 CD34和CD45(Abcam公司)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)；Trizol(Invitrogen公司)； OricellTMC57BL/6小鼠脂肪间质干细胞成骨诱导分化培养基试剂盒和 OricellTMC57BL/6小鼠脂肪间质干细胞成脂诱导分化培养基试剂盒(Cyagen公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠BMSCs的分离培养： DMB的给药浓度根据以往文献报道使用。取6周龄雄性小鼠断颈处死，无菌条件下取小鼠股骨和胫骨。37 ℃、5% CO2孵箱中培养细胞。每3 d换1次液。

1.2.2 BMSCs的鉴定：取第3代骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)，PBS清洗3次，加入0.25%的胰蛋白酶，消化2 min，加入含有血清的培养基终止消化，吹打至细胞悬液，离心，加入配制好的荧光一抗CD29、Sca-1、CD34和CD45孵育，4 ℃过夜；离心，PBS清洗；离心，PBS吹打至细胞悬液，检测。

1.2.3 MTT法检测BMSCs增殖：取第3代BMSCs，第一组分组为对照组和DMB (10-7、10-8和10-9mol/L)组，培养48 h，MTT检测。第二组分组为对照组和DMB 10-7mol/L(24、48和72 h)组。每孔加入20 μL MTT，孵育4 h，弃去上清液，加入150 μL DMSO，振荡，用多功能酶标仪在490 nm波长检测各孔的吸光度值。

1.2.4 BMSCs成骨分化的诱导培养：当第3代间充质干细胞汇合度达到80%～90%时，用0.25% Trypsin-0.01% EDTA进行消化。将消化下来的间充质干细胞按照2×104cells/cm2的细胞密度接种在6孔板中，按试剂盒的说明书操作。

1.2.5 BMSCs成脂分化的诱导培养：当第3代间充质干细胞汇合度达到80%～90%时，用0.25% Trypsin-0.01% EDTA进行消化。将消化下来的干细胞按照2×104cells/cm2的细胞密度接种在6孔板中，按试剂盒的说明书操作。

1.2.6 Western blot检测蛋白表达：弃细胞上清液，PBS洗3次，加入含有PMSF和磷酸酶抑制剂的RIPA，裂解细胞， 12 000 r/min离心15min,提取上清，BCA蛋白定量，制备样品。根据不同浓度，采取上30 μg的蛋白量。电泳：添加电泳缓冲液，至与胶面平齐，上样。电泳电压80 V/120 V;转膜：先将PVDF膜泡甲醇10 s，去离子水泡5 min，转膜缓冲液泡5 min，转膜夹板的顺序:人造棉-3层滤纸-胶-3层滤纸-人造棉，转膜电压100 V，100 min；丽春红染色：将膜放入丽春红染色液中室温染色2 min，随后去离子水清洗，观察红色条带。根据需要剪下相应的条带。封闭：将条带放入脱脂牛奶中室温封闭2 h；洗膜：用清水将牛奶洗净；孵育一抗：PBST稀释一抗，一抗封闭PVDF膜4 ℃过夜；洗膜：将PVDF膜在一抗中取出，PBST洗3次/10 min；孵育二抗：将PVDF膜放入二抗中，室温孵育2 h；洗膜： PBST洗3次/10 min；发光：发光液的配置为A和B液等体积混匀，用化学发光仪检测蛋白的表达。

1.2.7 Real-time PCR检测基因表达:用Trizol试剂提取细胞RNA。检测RNA浓度。按照试剂盒说明进行反转录。RT-PCR扩增条件为：DNA变性，95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，变性；55 ℃、30 s，退火；72 ℃、40 s，延伸，循环数为30次；最后延伸72 ℃、5 min。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Squences of primer

1.2.8 Micro-CT检测小鼠骨形成：小鼠用5%水合氯醛麻醉后，放置于micro-CT仪中扫描股骨。像素10 μm。通过三维立体构图测量骨体积/总体积、骨小梁数量、厚度等数据。软件为Inveon Research Workplace 2.2和SIEMENS Healthineers。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 流式细胞术鉴定BMSCs及检测增殖

表达Sca-1和CD29的细胞占总细胞数的91.2%，表达CD34和CD45的细胞占总细胞数的0.4%(图1A)。DMB促进细胞的增殖依赖于作用时间和浓度(图1B)。

2.2 DMB促进间充质干细胞向成骨细胞分化抑制向脂肪细胞分化

随着DMB浓度的提高，矿化结节的形成越多(图2A)。随着DMB浓度的提高，脂滴的形成越来越少(图2B)。不仅如此， DMB可以提高Runx-2和Osterix的表达(图2C)，抑制PPARγ的表达。DMB可以提高Runx-2和Osterix的表达，抑制PPARγ mRNA的表达(图2D)。

A.flow cytometry; B.the proliferation of BMSCs;*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control

A.Alizarin red staining; B.Oil red O staining; C.Western blot; D.RT-PCR; scale bars=50 μm;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with control

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with OVX图3 micro-CT检测骨形成Fig 3 micro-CT examined the bone n=3)

2.3 DMB可以促进骨形成，缓解骨质疏松

OVX组小鼠的骨量显著低于对照组小鼠(P<0.001)。DMB组小鼠的骨量明显高于OVX组(P<0.001)。DMB组可以促进骨小梁的数量和厚度(P<0.001)(图3)。

3 讨论

DMB是一种小分子量的GLP-1受体激动剂，研究证实DMB对于小鼠脑缺血再灌注导致的脑损伤具有保护作用，但是对于DMB能够促进骨形成，缓解骨质疏松症尚不清楚。本实验首先通过纯化的方法获得间充质干细胞，并且根据干细胞的表面特异性蛋白表达，流式细胞术鉴定发现表达干细胞阳性蛋白CD29和Sca-1的细胞占总细胞的95.5%,表达阴性蛋白CD34和CD45的细胞占总细胞数的0.4%。MTT法检测结果确定DMB对于间充质干细胞的增殖是浓度和时间依赖性的。干细胞具有分化为多种类型的细胞例如成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等的分化能力。成骨诱导培养基或成脂诱导培养基培养细胞，并且给予不同浓度的DMB刺激，通过茜素红和油红O染色发现，DMB可以促进间充质干细胞向成骨细胞分化，抑制向脂肪细胞分化，Western blot和RT-PCR的结果同样证明DMB促进成骨分化，抑制成脂分化。最后，Micro-CT结果显示，DMB能够促进骨小梁数量及厚度，从而促进骨形成。以上结果说明DMB可以作为抗骨质疏松的药物与其他GLP-1受体激动剂联合使用，提高激动剂与受体的结合，为临床的靶向治疗提供一个解决方法。但是DMB如何促进间充质干细胞向成骨细胞分化，抑制向脂肪细胞分化尚不清楚。不仅如此，DMB在体内如何通过间充质干细胞促进骨形成机制也尚不清楚。DMB与以往的GLP-1R激动剂在促进骨形成中具有怎样的优势仍不清楚，需要进一步研究。