RIPK2介导自噬对高糖诱导的 小鼠肾系膜细胞ROS、caspase- 1及IL- 1β表达的激活作用

周路平，陈 娇，徐 勇*，黄 炜，龙 洋，丁静雅1,，秦露丹1,

(1.西南医科大学，四川 泸州 646000； 2.西南医科大学附属医院 内分泌科，四川 泸州 646000； 3.绵阳市第三人民医院 内分泌科， 四川 绵阳 621000)

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease，DKD)发病机制复杂，高糖等代谢紊乱通过诱导活性氧(reactive oxygen species, ROS)生成、caspase- 1和IL- 1β炎性反应介质的过度活化导致肾脏炎性损伤[1]。自噬(autophagy)广泛参与多种信号通路的调控[2- 3]，研究发现，受体结合丝氨酸/苏氨酸激酶2(receptor interacting serine/threonine protein kinase 2, RIPK2)通过介导自噬可能参与ROS及相关炎性反应信号的调控[4]。但RIPK2介导自噬与高糖诱导的ROS、caspase- 1和IL- 1β炎性反应介质过度活化的关系尚不明确。本研究通过沉默RIPK2等手段，探讨高糖环境下RIPK2介导自噬对小鼠肾系膜细胞ROS、caspase- 1及IL- 1β表达的调控作用，为DKD防治提供新思路新靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞:小鼠肾系膜细胞系(SV40 MES13，中国典型培养物保藏中心)。

1.1.2 试剂：胎牛血清(Gibco公司)；DMEM低糖培养基(Hyclone公司)；RIPK2 siRNA及FECTTMCP转染试剂(广州锐博生物科技有限公司)；mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒(上海汉恒生物科技有限公司)；PVDF膜(Millipore公司)；兔抗小鼠RIPK2单克隆抗体(CST公司)；兔抗小鼠LC3Ⅱ/Ⅰ多克隆抗体、兔抗小鼠caspase1多克隆抗体和兔抗小鼠IL- 1β多克隆抗体(Abcam公司)；DCFH-DA荧光探针、兔抗小鼠β-actin单克隆抗体和HRP标记的二抗(碧云天生物技术公司)；化学发光试剂(Millipore公司)；总RNA提取试剂盒(北京天根生化公司)；反转录试剂盒(Toyobo公司)；小鼠IL- 1β ELISA检测试剂盒(北京诚林生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞分组及处理：将小鼠肾系膜细胞系培养于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM低糖培养基。培养条件为37 ℃、5% CO2。取对数增殖期细胞随机分组：1)NC组：培养基含5.6 mmol/L葡萄糖；2)高糖干预组(HG组)：据葡萄糖浓度(培养基含10、20和30 mmol/L葡萄糖)分为HG1、HG2和HG3组；3)渗透压对照组(OP组)：培养基含5.6 mmol/L葡萄糖+24.4 mmol/L甘露醇；分别作用2、6、12、24、48和72 h备用。

1.2.2 RIPK2 siRNA转染:将对数增殖期的细胞消化后接种于24孔培养板，分为空白组(NC组)、阴性对照组(转染control-siRNA)和siRNA实验组(转染siRNA-RIPK序列：正义链5′-GGGAAGTGTTAT CCAGAAA-3′；反义链5′-UUUCUGGAUAACACUUC CC-3′)，使用不含抗生素的低糖DMEM培养基在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞增殖至30%～50%汇合时转染，使siRNA终浓度为100 nmol/L，转染24 h后，加入上述高糖刺激，收集细胞及培养上清备用。

1.2.3 自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)感染细胞：将细胞接种到35 mm共聚焦专用培养皿，待细胞汇合率约40%时行mRFP-GFP-LC3自噬双标腺病毒感染，48 h后，用激光共聚焦显微镜观察自噬流，红色斑点即自噬溶酶体，黄色斑点即自噬体，拍照分析。

1.2.4 细胞ROS的检测：将DCFH-DA荧光探针加入细胞中，于37 ℃，5% CO2培养箱中孵育20 min后去除含探针培养液，30 min内于全光谱分光光度计上检测，激发光波长485 nm，发射光波长525 nm。ROS水平(%)=干预组荧光值/对照组荧光值×100%。

1.2.5 细胞蛋白的Western blot检测：抽提细胞总蛋白，加样品电泳，转膜，封闭，PVDF膜上孵育兔抗小鼠RIPK2多克隆抗体(稀释比例：1∶1 000)；兔抗小鼠LC3Ⅱ/Ⅰ多克隆抗体(稀释比例：1∶1 000)、兔抗小鼠caspase1多克隆抗体(稀释比例：1∶800)和兔抗小鼠IL- 1β多克隆抗体(稀释比例：1∶800)和兔抗小鼠β-actin单克隆抗体(稀释比例：1∶1 000)，4 ℃过夜，PBST洗膜后分别用HRP标记的二抗(稀释比例：1∶3 000)孵育1 h，化学发光显影。以目的蛋白与GAPDH蛋白条带平均吸光度值之比表示蛋白相对表达量。

1.2.6 细胞mRNA的RT-PCR检测：用总RNA提取试剂盒抽提细胞mRNA，用反转录试剂盒将mRNA反转录为cDNA，后用合成的RIPK2、caspase- 1和IL- 1β引物(表1)进行PCR扩增。扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳，电泳结束后取出凝胶并置于紫外凝胶成像系统(Image Lab)中成相。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 A list of primers used in the reactions of RT-PCR

1.2.7 细胞培养上清液的ELISA检测：收集细胞培养上清液，按照小鼠IL- 1β ELISA检测试剂盒说明书步骤进行，使用酶标仪在450 nm波长依次测量各孔的吸光度(A值)。以标准品的浓度及对应A值计算出标准曲线的直线回归方程，据直线回归方程计算出相应的样品浓度。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 高糖诱导肾系膜细胞ROS、caspase- 1及IL- 1β过度活化

与NC组比较，30 mmol/L高糖作用2、6、12、24、48及72 h呈时间依赖性升高肾系膜细胞ROS水平(P<0.05)；与NC组和OP组比较，10、20和30 mmol/L高糖作用12 h或72 h均呈浓度依赖性诱导系膜细胞ROS升高(P<0.05)(图1A)；随高糖作用时间延长和刺激浓度增高，caspase1和IL- 1β蛋白表达呈递增趋势(P<0.05))(图1B)；高糖呈时间-浓度依赖性升高培养上清IL- 1β浓度(P<0.05)(图1C)。

2.2 高糖对肾系膜细胞RIPK2、LC3Ⅱ/Ⅰ表达及自噬的双重调控

30 mmol/L高糖作用2、6、12、24、48及72 h后，RIPK2蛋白及mRNA表达先随高糖作用时间延长而逐渐升高，12 h达到峰值；超过12 h后其表达逐渐下降，72 h表达最弱(P<0.05)(图2A)；不同浓度高糖作用细胞12 h后，RIPK2蛋白及mRNA呈浓度依赖性升高(P<0.05)；不同高糖浓度作用细胞72 h后，PIPK2表达呈浓度依赖性降低(P<0.05)(图2B)。

随着高糖作用时间的延长，LC3Ⅱ/Ⅰ表达比值和细胞自噬流先呈递增趋势(图3A，3B)，于12 h表达达到峰值(P<0.05)，超过12 h后表达呈逐渐下降，于72 h表达最弱(P<0.05)；不同浓度高糖作用细胞12 h后，LC3Ⅱ/Ⅰ表达比值呈浓度依赖性升高(P<0.05)；不同高糖浓度作用细胞72 h后，LC3Ⅱ/Ⅰ表达比值呈浓度依赖性下降(P<0.05)(图3C)。

2.3 RIPK2介导自噬负性调控高糖诱导的ROS、caspase- 1及IL- 1β的过度活化

与NC组比较，RIPK2基因沉默组RIPK2、LC3Ⅱ/Ⅰ表达比值下降(P<0.05)，而caspase- 1、IL- 1β蛋白及mRNA表达明显增加(P<0.05)；与30 mmol/L高糖组比较，RIPK2基因沉默逆转高糖作用12 h诱导的LC3Ⅱ/Ⅰ比值上调(P<0.05)(图4A)；细胞ROS的水平同样被RIPK2基因沉默所调控(P<0.05)(图4B)；RIPK2基因沉默组细胞自噬流均被显著抑制(P<0.05)(图4C)。此外，RIPK2基因沉默显著易化了高糖诱导的IL- 1β分泌(P<0.05)(图4D)。

3 讨论

炎性反应信号通常作为一种防御性机制被激活，而自噬对于细胞稳态的维持起关键作用，两者在DKD发病中均扮演重要角色。研究表明，长期高糖抑制自噬，导致DKD患者肾小球和肾小管细胞肥大，足细胞损伤和肾小球滤过率下降[5- 6]；自噬诱导剂雷帕霉素干预可以抑制NLRP3炎性反应小体及下游炎性反应介质caspase- 1和IL- 1β激活，改善DKD模型动物肾功能[7]。到目前为止，肾系膜细胞自噬对炎性反应信号的调控尤其是高糖对自噬的短期及长期效应尚缺乏研究数据。本研究观察到肾系膜细胞在正常情况下维持较高自噬水平，短期(0～12 h)高糖刺激诱导自噬， 而高糖刺激超过12 h后则抑制自噬，此过程伴随ROS的生成和caspase- 1及IL- 1β过度激活，据此推测短时间(0～12 h)高糖刺激增加损伤线粒体集聚及ROS的产生，通过抑制mTOR或激活ERK和JNK p53而诱导自噬以清除损伤线粒体、ROS及继发激活的下游炎性反应介质，二者互为因果，难以判断发生的先后顺序，当二者间达到平衡时即形成一个自噬峰值；而长期持续(12～72 h)高糖刺激诱导更多损伤线粒体及蛋白质等产生并明显抑制自噬，一旦超过自噬清除能力，ROS即大量释放入胞质诱导炎性反应小体及下游的促炎因子活化。

GMCs were treated with 30 mmol/L high glucose for 2，6，12，24，48，72 hours, or were stimulated by the indicated concentrations of high glucose for 12 or 72 hours, ROS levels in the cells of each group were detected by kit(A); the expression of caspase-1 and IL-1β were assayed by Western blot (B); the content of IL-1β in culture supernatant were detected by ELISA(C);*P<0.05 compared with NC group;#P< 0.05 compared with osmotic pressure (OP) control group;▲P< 0.05 compared with 30 mmol/L glucose (HG3) stimulates for 12 hours group

GMCs were treated with 30 mmol/L high glucose for 2,6,12,24,48,72 hours(A), or were stimulated by the indicated concentrations of high glucose for 12 or 72 hours(B), the protein and mRNA expression of RIPK2 were detected by Western blot and RT-PCR；*P<0.05 compared with NC group;#P< 0.05 compared with osmotic pressure (OP) control group;▲P< 0.05 compared with 30 mmol/L glucose (HG3) stimulates for 12 hours group

GMCs were treated with 30 mmol/L high glucose for 2,6,12,24,48,72 hours, the relative protein level of LC3Ⅱ/Ⅰ(A)and the indicator of autophagy[autophagosomes (green) and autolysosomes (red) for colocalization as autophagy (yellow) , ×1024](B)by Western blot and confocal microscopy; GMCs were stimulated by the indicated concentrations of high glucose for 12 or 72 hours, the relative expression of L3C3Ⅱ/Ⅰ(C)were detected by Western blot;*P<0.05 compared with NC group;#P<0.05 compared with osmotic pressure (OP) control group;▲P<0.05 compared with 30 mmol/L glucose (HG3) stimulates for 12 hours group

After siRNA-RIPK2, the protein and mRNA expression of RIPK2, LC3Ⅱ/Ⅰ，caspase-1 and IL-1β were detected by Western blot and RT-PCR(A); the ROS levels in the cells of each group were detected by kit (B); the indicator of autophagy [autophagosomes (green) and autolysosomes (red) for colocalization as autophagy(yellow) , ×1024] were observed by confocal microscopy (C) ; the content of IL-1β in culture supernatant were detected by ELISA (D);*P<0.05 compared with NC group；#P<0.05 compared with 30 mmol/L glucose (HG3) stimulation group

图4RIPK2介导自噬负性调控高糖诱导的ROS、caspase1及IL-1β活化

研究发现，RIPK2作为NOD1、NOD2下游的调节蛋白，既可激活核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)及丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases, MAPKs)介导炎性反应，还可能调控自噬及ROS及NLRP3炎性反应小体信号[8- 9]。目前RIPK2通过何种机制诱导自噬的研究尚少，本研究发现短期高糖刺激激活RIPK2表达，而长期持续高糖则抑制RIPK2表达，与LC3Ⅱ/Ⅰ表达趋势基本一致，提示RIPK2可能介导高糖对肾系膜细胞自噬的双向调控。基因沉默RIPK2结果证实，持续高糖刺激通过抑制RIPK2，抑制了细胞的自噬水平并活化caspase-1及IL- 1β，提示RIPK2介导的自噬负性调控高糖诱导的ROS、caspase-1及IL- 1β过度活化，但其具体调控的分子机制还有待进一步探索。

综上所述，本研究发现高糖对肾系膜细胞自噬起双向调控作用，RIPK2介导自噬参与负性调控高糖诱导的ROS、caspase- 1及IL- 1β过度活化，推测适当诱导RIPK2及自噬水平可能是有效抑制DKD肾脏炎性反应损伤的潜在靶点。