COX-2-PGE2-EP在白藜芦醇抗结直肠癌中的作用研究

李燕 ，彭芳 ，钟斌 ，冯李长 ，张羽 ，徐小军

(1、赣南医学院第一附属医院；2、赣州市人民医院；3、赣南医学院，江西 赣州 341000)

结直肠癌(colorectal cancer)是全球第四大癌症相关死亡原因，每年估计有超过60万人死于结直肠癌，约占所有癌症死亡病例的8%[1]。随着近年来生活方式的改变，我国结直肠癌的发病率不断上升，2012中国肿瘤登记年报显示，肿瘤发病的排位中，结直肠癌首次超过胃癌，跃居第2位[2]。

80%的结直肠癌是由腺瘤性息肉演变而来，癌变前有长达10年的良性肿瘤发展阶段，该时间窗为结直肠癌的预防和早期诊断提供了有利的时机[3]。白藜芦醇为蒽醌萜类化合物，诸多医学研究表明，白藜芦醇能够抑制肿瘤发生发展中的多条信号通路，但其机制有待更深入的研究。

环氧合酶（COX）是前列腺素（PGs）合成过程的重要限速酶，COX-2在大多数组织中呈诱导性表达，并能被多种刺激因素如炎症刺激、生长因子、细胞因子和某些癌蛋白等诱导而表达[5-10]，参与炎症和肿瘤的发生、发展。本文研究COX-2在白藜芦醇抗结肠癌中的作用及机制，为白藜芦醇化学预防及辅助治疗结肠癌提供理论及实验依据。

1 材料和方法

1.1 病例资料 收集我院2015年1月-2015年12月结直肠腺癌、腺瘤性息肉和“正常”结肠黏膜标本各50例及HT-29结肠癌细胞。

1.2 实验材料 一抗兔抗人COX-2多克隆抗体、HT-29结肠癌细胞。

1.3 实验方法 实验采用免疫组织化学方法检测COX-2在结直肠腺癌、腺瘤性息肉和“正常”结肠黏膜标本、HT-29结肠癌细胞及白藜芦醇培养的HT-29结肠癌细胞中的表达情况。免疫组织化学试剂一抗COX-2多克隆抗体购自福建迈新公司。采用福建迈新公司的Elivision试剂盒。石蜡切片厚度3微米，60℃烤箱烤片1h；先用梯度二甲苯脱蜡，继以梯度乙醇水化，再用蒸馏水浸泡5min；用3%过氧化氢室温孵育10min阻断内源性过氧化酶的活性，再用PBS液冲洗，高压锅抗原修复，最后自然冷却至室温。加入二步法Elivision试剂盒中试剂 A，室温孵育20min，PBS冲洗 3次，每次5min，再加入试剂盒中的试剂B，室温下孵育30min，PBS冲洗3次，每次5min。在镜下控制DAB显色，蒸馏水冲洗终止反应。苏木素复染，盐酸酒精分化后用自来水冲洗返蓝，脱水，透明，最后用中性树胶封片，每次均做阳性对照及PBS代替一抗做阴性对照。

免疫组织化学判断的标准：定位准确，呈棕黄色颗粒为阳性，COX-2阳性定位于细胞浆或细胞膜， 阳性细胞小于10%为 （-），11%-25%为 （+），26%-50%为（++），51%-75%为（+++），76%-100%为（++++）。

2 实验结果

免疫组织化学方法检测结直肠腺癌、腺瘤性息肉和“正常”结肠黏膜标本中COX-2蛋白的表达情况(见图1)：腺癌组阳性35例（阳性率70%）；腺瘤性息肉组阳性10例（阳性率20%）；“正常”结肠黏膜阳性2例（阳性率4%）；HT-29结肠癌细胞表达（阳性率70%）；白藜芦醇培养的HT-29结肠癌细胞（阳性率50%）。

免疫组织化学结果显示环氧合酶-2（COX-2）在结肠腺癌中表达明显高于腺瘤，但在正常黏膜上皮中几乎不表达，HT-29结肠癌细胞表达高于白藜芦醇培养的HT-29结肠癌细胞。差别有统计学意义（P＜0.05）。 见图 1。

图1 免疫组织化学结果

3 讨论

结直肠腺瘤向结直肠癌的逐级发展提示，特定的化学预防可延缓或防止浸润性结直肠癌的发展。结直肠腺瘤/结直肠癌预防计划（CAPP2）近期提供的数据显示，在一项随机、安慰剂对照试验中，受试者每天服用600mg阿司匹林并至少持续2年之后，CRC的发病率明显下降60%[4]。该临床试验表明，阿司匹林可以防止结直肠腺瘤及其潜在肿瘤的形成，但长期大剂量服用阿司匹林可能的消化道出血风险限制了其作为化学预防药物的使用。因此，在天然药物有效成份中发掘预防和治疗结直肠癌的药物具有重要的研究价值。

白藜芦醇为蒽醌萜类化合物，主要来源于蓼科植物虎杖的干燥根茎和根，豆科植物花生的种子，葡萄科植物葡萄果实的皮和籽等。Garvin S等[5]在体内实验研究发现，白藜芦醇能诱导人乳腺癌细胞凋亡并抑制其血管生成。有资料表明[6]：白藜芦醇也能促进胃腺癌细胞的凋亡，但其诱导凋亡的机制仍有待研究。最新的研究证实：白藜芦醇与顺铂、奥沙利铂联用可增强后者对结直肠癌的化疗效果，减少耐药的发生；通过抑制脂多糖诱导的NF-κB激活，减少结直肠癌细胞的炎症反应；抑制结直肠癌细胞增殖与血管生成，促进癌细胞凋亡[7-9]。

目前研究发现，COX-2通过促进PGE2的合成，诱导前致癌物的活化、抑制凋亡、促进肿瘤新生血管的形成、增加肿瘤细胞的浸润与转移[11]。PGE2是一种重要的细胞生长调节因子，发挥广泛的与炎症和癌症有关的生物学效应，过表达的COX-2可促进PGE2的合成，进而直接刺激有丝分裂，最终诱导成骨细胞和乳腺上皮细胞的肿瘤发生[12]。PGE2通过与G蛋白偶联的前列腺素受体（E-prostanoid receptors，EP）结合而发挥生物学效应，EP 有四种亚型，即 EP1、EP2、EP3 及 EP4，它们分布于机体的各种组织和细胞中，它们与PGE2结合后被激活，通过与G蛋白偶联产生第二信使，将细胞外的信号传到细胞内，引起一系列的生理或病理效应[13-15]。COX-2/PGE2/EP信号传导通路在结直肠癌发生发展中的重要作用，本研究发现白藜芦醇可减少COX-2表达进而显著抑制肿瘤细胞增殖，为进一步阐明白藜芦醇抗结肠癌的具体机制提供了理论及实验依据。