肺结核病患者外周血单个核细胞中环状RNA circRNF10的表达及意义

闻芳 ，姚芳苡 ，黄自坤 ，彭亦平 ，傅颖媛

(1、南昌大学基础医学院免疫学教研室，江西 南昌 330006；2、江西省血液中心检验科，江西 南昌 330052；3、南昌大学第一附属医院检验科，江西 南昌 330006；4、江西省胸科医院内二科，江西 南昌 330006)

结核病是严重危害人类健康的感染性疾病。我国结核病患者人数居全球第三位，被WHO列为全球22个结核病高负担国家之一[1]。结核病的早期诊断及治疗对结核的防治有至关重要的意义。环状 RNA（circular RNA，circRNA）是新近发现的一类内源性非编码RNA，其呈环状而得名[2，3]。近年研究表明环状RNA不受RNA外切酶影响，表达更稳定，大量存在于真核细胞中，具有一定的组织、时序和疾病特异性，在转录、翻译以及转录后调控等多种层面上影响基因的表达和功能，广泛参与机体各种生理和病理过程[4-6]。同时，环状RNA的异常表达与包括恶性肿瘤、神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫病在内的多种疾病的发生发展密切相关[7，8]。随着环状RNA研究的进一步深入，越来越多的证据表明环状RNA表达谱会随着疾病进程发生变化，同时，环状RNA能够稳定存在外周血中，其检测对于疾病诊断判断预后具有重要意义[9]。在前期工作中，课题组采用高通量基因芯片筛查发现肺结核患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMC） 中 circRNF10（又名hsa_环状RNA_005086）表达显著升高[10]，提示其可能作为结核病诊断标志物。因此，本研究旨在检测circRNF10在肺结核病患者PBMC中的表达水平，探讨其在肺结核病诊断、疗效监测中的价值。

1 资料与方法

1.1 病例资料 ⑴肺结核组：收集2016年3月至2017年3月江西省胸科医院结核科收治的初治活动性肺结核患者90例，男58例，女32例，平均年龄（40.5±12.4）岁。肺结核的诊断依据按照2005年中华医学会《临床诊疗手册（结核病分册）》诊断标准[11]，并除外心、肝、肾等脏器并发症。90例肺结核患者依据肺部病灶所占的范围、肺部有无空洞进行分组，经胸部CT诊断，按照肺部有无空洞分为无空洞组57例和有空洞组33例；据影像学肺部病灶所占的范围分为＜2个肺野组51例，≥2个肺野组39例。所有肺结核患者均在抗结核治疗前采血。肺结核患者给予规范化治疗：异烟肼+利福平+乙胺丁醇+吡嗪酰胺2个月，异烟肼+利福平4个月。20例肺结核患者均在规范化抗结核治疗3月和6月后采血。⑵肺炎组：收集同期南昌大学第一附属医院住院肺炎患者40例，其中男26例，女14例，平均年龄（37.9±11.8）岁。入组病例均未接受过放、化疗及其他免疫治疗、无结核病接触史。⑶肺癌组：收集同期南昌大学第一附属医院住院肺癌患者40例，其中男27例，女13例，平均年龄（45.5±9.7）岁。入组病例均经过病理诊断确诊，未接受过放、化疗及其他免疫治疗、无结核病接触史。⑷健康对照组：收集同期南昌大学第一附属医院进行体检的健康人70例，其中男46例，女24例，平均年龄（38.7±11.6）岁。入组对象胸部影像学检查均正常，无结核病接触史。

所有对象均排除合并高血压、糖尿病、慢性阻塞性肺疾病、自身免疫性疾病及服用免疫抑制药物的患者；排除HBV、HCV、HIV感染者或 （和）AIDS患者；排除孕妇或哺乳期妇女。本研究经南昌大学第一附属医院医学伦理学委员会批准，标本的收取及患者信息的使用已获得患者及家属知情同意，所有患者及志愿者均签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 逆转录试剂及实时荧光定量PCR试剂购自日本TaKaRa公司；Trizol试剂及荧光定量PCR引物购自美国Invitrogen公司；Ficoll淋巴细胞分离液购自美国sigma公司；荧光定量PCR仪美国ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 样本采集及处理 采集研究对象空腹静脉血，EDTA-K2抗凝，按常规方法用Ficoll淋巴细胞分离液提取PBMC。

1.3.2 总RNA提取及cDNA合成 向PBMC细胞沉淀物中加入1ml Trizol试剂，按Trizol试剂说明书提取PBMC样本总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。取1μl RNA，按照说明书，利用逆转录试剂盒逆转录为cDNA。

1.3.3 实时荧光定量PCR 采用SYBR法进行实时荧光定量PCR检测，检测步骤及反应条件参照试剂盒说明书进行。circRNF10上游引物为：5'-ACCTGCTCCTCTGATTCTGCT-3'，下游引物为 5'-GGTGAGTGGCAAGTGAGAGA-3'；内参 β-actin 基因上游引物为5'-CATGTACGTTGCTATCCAGGG-3'，下游引物为5'-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3'。 反应体系为 20μl，即：1×SYBR Green I mastermix、0.5μmol/L 特异前向引物、0.5μmol/L 特异反向引物、1μl反转录产物。反应条件为：预变性95℃10min，95℃ 15s，60℃ 1min，72℃ 30s，40 循环，通过熔解曲线检测PCR产物的特异性。荧光定量PCR检测使用ABI 7500仪器进行。每孔均设3个复孔，取平均Ct值做为该样本最后Ct值，以βactin基因作为内参基因，计算2-△△Ct值反映circRNF10表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计学处理。以Kolmogorov-Smirnov检验（K-S检验）对数据进行正态分布检验，正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，两样本均数比较采用t检验，多组间的比较采用单因素方差分析。采用GraphPad Prism 5软件绘制受试者工作特征曲线（receiver operator characteristic curve，ROC）， 并计算曲线下面积 （area under of ROC curve，AUC）评估PBMC中circRNF10的检验效能。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分组circRNF10表达水平比较分析 采用实时荧光定量PCR检测PBMC中circRNF10在各亚组中表达情况[肺结核组（2.11±1.13）；健康对照组（1.00±0.38）；肺炎组（1.14±0.57）；肺癌组（0.93±0.31），发现肺结核患者circRNF10表达相比健康对照组、肺炎组和肺癌组表达高（F=38.15，P＜0.01；图1），其余3组PBMC中circRNF10表达无明显差异（F=2.75，P=0.07）。

图1 不同分组中PBMC中circRNF10表达水平的散点图

2.2 circRNF10表达与肺结核病灶范围及肺部空洞的关系 根据肺结核患者肺部空洞的情况分为无空洞组和有空洞组（图2A），检测结果显示，有空洞组 PBMC 中 circRNF10 表达（3.00±1.13）显著高于无空洞组 （1.60±0.76），差异有统计学意义 （t=7.02，P＜0.01）。根据影像学肺部病灶所占的范围分为＜2个肺野组和≥2个肺野组（图2B），检测结果显示，≥2个肺野组 PBMC中 circRNF10表达（2.68±1.18）显著高于＜2 个肺野组（1.67±0.87），差异有统计学意义（t=4.68，P＜0.01）。

图2 肺部不同病灶范围及肺部空洞组患者PBMC中circRNF10表达水平的散点图

2.3 抗结核治疗前后PBMC中circRNF10表达变化 我们对已收治的20例初治肺结核患者均进行了6个月的随访，检测患者接受抗结核治疗3个月及6个月后PBMC中circRNF10的表达变化。随访结果显示，随访患者抗结核治疗效果良好。荧光定量PCR检测结果如图3所示，与治疗前circRNF10表达水平 （2.31±0.72）相比，治疗3月（1.27±0.41）（t=5.62，P＜0.01）、6 月 （0.94±0.38）（t=7.54，P＜0.01）circRNF10 的表达水平均显著下降。与治疗3月组相比，治疗6月组circRNF10的表达水平显著降低（t=2.63，P=0.01）。此外，接受治疗6月组PBMC中circRNF10水平与健康对照组比较，差异无统计学意义（t=0.69，P=0.49）。

图3 肺结核患者抗结核治疗前后PBMC中circRNF10表达水平的散点图

2.4 circRNF10对结核病的诊断效能 为了评估PBMC中circRNF10的诊断效能，我们绘制了肺结核患者区别于健康对照组及肺炎、肺癌的ROC曲线。结果如图4所示，circRNF10在用于区别肺结核患者与健康对照者（图4A）、肺炎患者（图4B）及肺癌患者 （图 4C）的 AUC分别为 0.837、0.782、0.861。以1.37为临界值，circRNF10鉴别肺结核患者与健康对照的敏感度和特异度分别为88.57%和73.33%；以1.22为临界值，circRNF10鉴别肺结核患者与肺炎患者的敏感度和特异度分别为70.00%和80.00%；以1.26为临界值，circRNF10鉴别肺结核患者与肺癌患者的敏感度和特异度分别为87.50%和77.78%。

图4 circRNF10诊断肺结核病的ROC曲线

3 讨论

环状RNA（circRNA）是区别于传统线性RNA的一类新型非编码RNA分子，通常由前体mRNA经可变剪切产生，具有闭合环状结构，也是目前RNA领域最新的研究热点分子[12]。尽管目前大多数环状RNA的生物学功能尚不明确，但不少研究表明，环状RNA分子因富含微小RNA（microRNA，miRNA）结合位点，在细胞中起到一种类似于“miRNA海绵”的作用，它可以解除miRNA对其靶基因的抑制，从而提高靶基因表达水平[13]。此外，还有研究发现部分环状RNA可通过与RNA聚合酶Ⅱ相结合从而促进基因转录[14]，或充当RNA结合蛋白海绵，调控有关蛋白质的活性[15]，在人体多种疾病的发生、发展过程中发挥重要的调控作用。

近年研究发现一些特定的环状RNA具有疾病和组织特异性，人血清、血浆、唾液及其他体液中均有环状RNA表达，而且循环环状RNA具有良好的稳定性，这种稳定性也为其作为疾病诊断的标志物奠定了基础[16]。如，Zhao等[17]发现了外周血hsa_circ_0124644可作为冠心病的一个诊断性生物标志物。Teng等[18]发现了外周血hsa_circ_0021001可作为筛查颅内动脉瘤的新型生物标志物。此外，近期Ouyang等[19]研究发现PBMC 中 hsa_circ_104871，hsa_circ_003524，hsa_circ_101873和hsa_circ_103047可作为类风湿关节炎诊断的标志物。目前环状RNA在结核病中研究尚刚起步，相关研究鲜有报道。

本课题组前期通过高通量芯片技术筛选发现，与健康对照者比较，肺结核患者PBMC中环状RNA表达谱发生部分变化[10]。本实验中，我们以变化显著的circRNF10为研究对象，探讨其对肺结核的诊断价值。结果显示，相比于肺炎、肺癌患者及健康人群，肺结核患者PBMC中circRNF10的表达量升高。AUC结果显示circRNF10能区别肺结核患者与健康人及肺炎、肺癌患者，可作为诊断肺结核的有效标识。进一步据肺部病灶范围、肺部空洞不同临床表型进行分组分析，结果显示，肺部有空洞结核患者PBMC中circRNF10水平显著高于无空洞患者，肺部病灶范围大的患者显著高于病变范围小患者。提示PBMC中circRNF10水平在一定程度上或可反映肺结核炎症组织损伤的严重程度。

本研究对部分初治肺结核患者随访6个月，期间患者严格按照标准抗结核治疗方案接受治疗，均未接受放化疗及激素治疗等其他治疗，且患者抗结核治疗效果良好。结果发现与未接受治疗组患者相比，circRNF10在抗结核治疗3个月时表达明显下降，且随着治疗时间延长，circRNF10表达量逐渐降低。当接受6个月抗结核治疗后，随访患者中circRNF10表达量已下降至正常水平，与健康对照组比较无统计学差异。需要指出的是，由于本研究收集样本的时间较短，在90例肺结核患者中仅有20例患者均在规范化抗结核治疗3月和6月后完成采血。由于病例数较少，在其用于抗结核治疗效果评估时易出现误差。在下一步研究中，我们将在扩大样本量的同时对肺结核患者进行定期随访，以进一步分析PBMC中circRNF10的表达水平在肺结核患者抗结核疗效评价中的意义。

综上所述，circRNF10在肺结核患者PBMC中表达升高，有望成为结核病快速诊断的潜在生物标志物，同时或可用于抗结核治疗效果评估，但是circRNF10的调控机制仍未清楚，我们希望通过更多研究来了解circRNF10在结核病中是如何发挥作用的。