HPLC法测定双黄水凝胶中盐酸小檗碱的含量

岑志芳，吴晓纯，郑昊圳，陈丽纯，刘桂燕，罗文安，陈创伟

（佛山科学技术学院药学系，广东佛山528000）

双黄水凝胶是按照一定的处方量，以黄连和黄柏为主药，实验室自主研发配制而成的细腻均匀，易于涂布，渗透性良好的新型中药复方经皮给药制剂。其中黄连的有效成分主要为生物碱类季胺碱,如小檗碱等，属于广谱抗菌药物,具有清热燥湿、泻火解毒、抗菌消炎、利胆等药理作用［1］；黄柏味苦，性寒，常用于治疗清热燥湿、泻火解毒，消肿祛腐等症状［2］，小檗碱是其主要成分。黄连得黄柏相助，功专于下，加强清热燥湿、解毒泻火、抗菌消炎等作用，可用于治疗湿疹、湿疮、皮炎等疾病。盐酸小檗碱是双黄凝胶的主要的药效成分，因此，采用科学简便的含量测定方法，能够有效的进行定量分析，保证临床药效，也为后续质量控制标准的制定提供了依据。本文旨在用高效液相色谱法测定盐酸小檗碱的含量，为该药质量控制提供可行性手段。

1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪；JJ300型电子天平（常熟市双杰测试仪器厂）；UV-1600PC型紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；AS5150B超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）。

双黄凝胶（实验室自制，批号：170507；170508；170509）；盐酸小檗碱对照品（含量:86.8%，批号：110713-200911，中国药品生物制品检定所）；乙腈(色谱级，批号：JA028430，默克股份科技两合公司）；甲醇（色谱级，批号：I754507441，默克股份科技两合公司）；水（去离子水，实验室自制）；无水乙醇（分析纯，批号：160830，广东光华科技股份有限公司）；十二烷基硫酸钠（批号：980706，汕头光华化学厂）；磷酸二氢钾（批号：20170118，广东光华科技股份有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液制备

精密称量10 mg盐酸小檗碱对照品置100 mL容量瓶中，用甲醇溶液（含1%的盐酸）溶液溶解定容，摇匀，制得浓度为100 μg/mL标准储备溶液。

2.1.2 供试品溶液制备

精密称取制备好的双黄凝胶剂1 g用甲醇溶液（含1%的盐酸）溶解，少量多次转移并定容至10 mL，摇匀，再精密量取2 mL用流动相稀释定容至10 mL，摇匀即得。

2.1.3 阴性对照品制备

按处方比例配制不含药液的凝胶同2.1.2项的方法配制阴性对照品溶液。

2.2 测定波长选择

以阴性对照品作空白对照，将供试品溶液在紫外分光光度计上，于200～500 nm波长范围内进行扫描，选取最大吸收波长345 nm作为检测波长。

2.3 色谱条件

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05 mol·L-1磷酸二氢钾溶液（50∶50）（每100 ml中加十二烷基硫酸钠0.4 g，再以磷酸调节pH值为4.0）为流动相；流速为1.5 mL·min-1；检测波长为345 nm;柱温为室温。理论板数按盐酸小檗碱峰计算应不低于5 000［3］。

2.4 系统适应性实验

分别精密吸取对照溶液、阴性对照品溶液与供试品溶液各20 μL，在2.3项的色谱条件下测定。结果色谱行为良好，盐酸小檗碱峰与其他组分色谱峰可达到基线分离，且与相邻色谱峰分离度为5.00，理论板数28 486。供试品与对照品在同一保留时间的波峰出现，而阴性对照则无相应的干扰峰，说明本方法具有良好的专属性，见图1。

2.5 方法学考察

2.5.1 定量限

精密量取已知浓度的对照品溶液1 mL，进行一系列的稀释过程，直至信噪比S/N=10，此时浓度为2.55 μg/mL。

图1 双黄凝胶HPLC色谱图

2.5.2 线性关系的考察

已知对照品溶液浓度为105.6 μg/mL，分别精密吸取混合对照品溶液0.5，1，2，3，4，5 mL于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容，注入液相色谱仪中，按上述色谱条件测定，记录峰面积。以盐酸小檗碱浓度C为横坐标，峰面积积分值A为纵坐标，进行线性回归，得盐酸小檗碱的回归方程为A=70.640×C+12.841（r＝0.999 8，n＝6），线性范围为 4.58～45.83 μg·mL-1。

2.5.3 精密度试验

精密吸取盐酸小檗碱对照品溶液，每天进样1次，连续6 d测定峰面积，计算RSD%为0.59%。

表1 精密度试验结果（n=6）

2.5.4 重复性试验

精密称取同一批凝胶样品（批号：170507），照2.1.2项下方法平行制备2个不同浓度的样品，每个浓度配制三份供试品溶液，分别测定。盐酸小檗碱的平均含量分别为11.79 mg/g，RSD%为1.18%，表明方法的重复性良好。

表2 重复性实验结果（n=6）

2.5.5 稳定性试验

精密吸取同一份供试品溶液，分别于配置后0、1、2、4、8、12、24 h测定峰面积，盐酸小檗碱的RSD%为1.07%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

表3 稳定性试验结果（n=6）

2.5.6 加样回收试验

精密称取等量的同一批号样品（批号：170507）配制成供试品溶液（共9份），分别加入相当于样品含量50%、100%、150%不同质量浓度的对照品溶液适量，摇匀，再按上述色谱条件进样分析，回收率为99.74%，RSD=1.49%。

表4 加样回收率结果（n=9）

2.6 样品测定

精密称取3批样品各0.1 g，按上述供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，依上述色谱条件测定峰面积，并计算出样品中盐酸小檗碱的平均含量为11.92 mg/g。

表5 样品中盐酸小檗碱含量测定结果

3 讨论

中药制剂中测定盐酸小檗碱含量的方法主要有：分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法［4-5］，每种方法有各自的优缺点，本次实验采用高效液相色谱法来测定双黄凝胶中的主要药效成分盐酸小檗碱的含量，此法操作简便，精密稳定，灵敏度高，专属性好等优点。虽然已有文献报道采用HPLC法测定盐酸小檗碱的含量，但是分析的中药制剂成分不同，影响因素不同，测定波长和流动相也有所差别，因此方法在制定后要进行方法学考察，保证测定方法的准确性。

流动相的配置后必须经过超声脱气处理才可以使用，否则容易产生气泡堵住色谱柱，使分析结果不准确。盐酸小檗碱是季铵碱类生物碱，碱性极强，极性较大，在C18反相HPLC系统容易拖尾，因此在流动相中加入反离子试剂以形成离子对，能有效抑制拖尾，改善峰形，故本次实验中加入了十二烷基磺酸钠的离子缓冲盐［6-7］，可以有效防止拖尾，峰形分离效果良好，但是十二烷基磺酸钠是表面活性剂，易产生泡沫，噪音大，所以每次测定结束后都要较长时间洗柱，也有相关文献［8］采用加入了三乙醇胺也能有效防止拖尾，改善峰形。

药液在提取过程中使用的60%的乙醇溶液，小檗碱是呈游离态存在，故在配制供试品溶液时要滴加适量的盐酸溶液于甲醇中，使得小檗碱与盐酸反应生成盐酸小檗碱，使测得的结果更加准确。