蚓激酶提取纯化工艺的研究进展

董翔 王信营

【摘 要】蚓激酶，是一种常见的用于治疗心脑血管疾病的药物。它是从传统中药材蚯蚓发现的具有良好的活血、降血脂、降血粘的抗血栓活性物质。它与血栓有特殊的亲和力，能够跟踪溶栓，有效地溶解微栓，修复血管内皮受损细胞。蚓激酶具有副作用小、安全性高、疗效较显著的优势，它具有很广阔的市场前景。目前国内对蚓激酶的提取分离工艺的研究很多，因此本文主要对蚓激酶的提取与分离纯化工艺进行综述。

【关键词】蚓激酶；提取；分离纯化

蚯蚓，又称地龙，环节动物门（Annelida），毛足纲（Chaetopoda），种类很多，仅在我国境内就有200多种。在我国传统医药学中，蚯蚓作为中药具有解热、定惊、利尿、降压等功效，蚯蚓提取物中含有纤溶成分在我国古代医药文献中早已有记载。

1982年，Mihara等自粉正蚓中提取出一组具有纤溶活性的酶，命名为蚓激酶（lumbrinonase）。此后国内外对于蚓激酶的的分离纯化、理化性质、酶学活性和臨床药效进行了大量的研究。本文就其研究进展作一综述。

1 理化性质

蚓激酶是一组相对分子质量为18～42kD、pI3～5，具有纤溶酶活性的丝氨酸蛋白酶。它具有许多相似的特性：①热稳定性：在55℃以下放置1h，酶活力基本不变；超过60℃时，酶活力迅速下降；当温度达到70℃时，酶完全失活。②酸稳定性：其作用的pH范围较宽。在pH4～11活力变化很小，pH8～9时酶稳定性最好，活力较高[1]。

2 粗酶液的提取

2.1蚯蚓的预处理

称取蚯蚓，用自来水洗净至无土块和粪便，加入蚯蚓与食盐比例为10：1浓度的食用盐，观察到蚯蚓吐出大量的黄色粘液，可除净蚯蚓消化道的污物，搅拌10分钟后蚯蚓便被杀死。

2.2粗酶液的提取方法研究进展

2.2.1硫酸氨沉淀法

将已杀死的蚯蚓用清水清洗干净后，经组织匀浆机初匀后，加入等体积的pH7.80.02mol/L的Tris-HCl缓冲溶液（BufferA）于高压匀浆器中再次匀浆，4℃下抽提过夜。4℃，4000r/min离心60min，弃沉淀。上清液于4℃下继续保存直到有沉淀产生，再次4℃，4000r/min离心60min，弃沉淀，上清液经30%硫酸铵沉淀后4℃，4000r/min离心60min，取上清液。上清液经中空纤维超滤柱（MWCO为10kD）脱盐、浓缩并将缓冲溶液置换为BufferA，即为粗酶液[2]。

黄访[6]等采用了分段盐析的方法进行蚓激酶的提取，由于不同的蛋白质的溶解度与等电点不同，沉淀时所需的离子强度也不同，改变盐的浓度与溶液的pH值，可将混合液中的蛋白质分批盐析出来选择第一次盐析的最佳浓度为18.5%，35.9%作为第二次盐析的浓度，进而节省提取成本，提高所提取叫激酶的活性和纯度。

2.2.2丙酮沉淀法

取鲜活蚯蚓用水洗净后，匀浆，加冷丙酮搅匀后滤干制成蚯蚓丙酮粉，用一定量丙酮粉加pH7.8的0.05MTris-HCl缓冲液在5摄氏度下浸泡过夜，以15000r/min离心，得上清提取液[5]。

3 蚓激酶的分离纯化研究进展

3.1离子交换层析法

离子交换层析（IonExchangeChromatography简称为IEC）是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。目前离子交换层析仍是生物化学领域中常用的一种层析方法，广泛的应用于各种生化物质如氨基酸、蛋白、糖类、核苷酸等的分离纯化。常用的离子交换剂有：离子交换纤维素、离子交换葡聚糖和离子交换树脂。

应国清[3]等选用DEAE-纤维素为纯化蚓激酶的离子交换剂，以0.02mol/L，pH7.8磷酸缓冲液+0.5mol/LNaCI作为洗脱剂，蚓激酶纯化效果较好。蚓激酶比活达3.25μ/mg，比口服用蚓激酶活力提高了3.6倍。

3.2亲和柱色谱法

亲和色谱也称为亲和层析，是一种利用固定相的结合特性来分离分子的色谱方法。亲和色谱在凝胶过滤色谱柱上连接与待分离的物质有一定结合能力的分子，并且它们的结合是可逆的，在改变流动相条件时二者还能相互分离。亲和色谱可以用来从混合物中纯化或浓缩某一分子，也可以用来去除或减少混合物中某一分子的含量。

施媚[4]等研究了酸性和碱性条件下对蚯蚓纤溶酶的纯化效果。实验表明经壳聚糖为载体所制备的亲和吸附剂对蚓激酶具有较高的分离纯化选择性，并且在酸性条件下提取比在碱性条件下提取所得同工酶要少。

4 展望

蚓激酶目前在临床上主要是各种胶囊制剂，如普恩复、百奥、博洛克、溶栓胶囊等，由蚯蚓纤溶酶做成的口服制剂也有很多种，但在如何更好地发挥药效方面研究不多，而注射剂还没问世。蚓激酶作为外源蛋白质可能对人体产生免疫原性，而分子量小的组分对人体的免疫原性可能会低些，所以有必要分离纯化低分子组分，为注射剂的研制开发打下基础。蚯蚓纤溶酶可以直接由肠上皮吸收，是一种具有“穿肠而过”功能的生物大分子。所以，纤溶酶口服制剂宜制成肠溶型。

参考文献

[1]王承利，张贺，王洋，等.蚓激酶研究进展[J].沈阳部队医药，2010，3（23）：200.

[2]周海，王春维，张怡，等.蚓激酶的提取纯化及性质研究[J].中国生化药物杂志，2011，3（32）：213-214.

[3]应国清，许建议.离子交换层析法分离纯化绷激酶的研究[J].浙江工业大学学报，1998，6（26）：125-126.

[4]施媚，何执中.以壳聚糖为基质对蚯蚓纤溶酶进行亲和层析[J].安徽师范大学学报（自然科学版），2007，1（30）：65-66.

[5]涂清波，陆冬莺，林颖，等.正交试验法优选蚓激酶提取工艺研究[J].中国民族民间医药，2017，22（26）：16-17.

[6]黄访，王红，李维尊，等.一种蚯蚓中蚓激酶高效提取的方法[P].中国专利：CN105907738A，2016-08-31.

作者简介：

董翔（1997.3-）女，汉族，籍贯山东省青岛市，本科 在读学生。