LAMP和荧光定量PCR检测食品中致病微生物的对比分析

广州市黄埔区疾病预防控制中心（510700）钟秀茵 杨晓斌 刘钰钗 何湘鹃

附图1 LAMP反应后可见沉淀，1、2为沙门菌，3、4为大肠埃希菌，5、6、7为金黄色葡萄球菌。LAMP反应后凝胶电泳结果可见连续阶梯状条带，M为DNA标记，1、2为沙门菌，3、4为大肠埃希菌，5、6、7为金黄色葡萄球菌

附图2 荧光定量PCR反应后目的基因溶解曲线

食源性疾病主要是指食品中致病微生物进入人体中而引发的感染性或中毒性疾病[1]。本次研究采用环介导等温扩增技术与荧光定量聚合酶链反应技术对各类食物标本中的3种致病微生物进行检测，对其检测效果进行比较，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 基本资料 选取携带有致病微生物的50份米粉、50份污水及50份罐头作为检测样本，分别在检测样本中接种浓度为10cfu/ml的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌等菌株（均由本实验室保存，并接种于营养琼脂斜面，在37℃环境下培养18小时后，反复转接3次后即可作为备用）各1ml，其中，米粉10g（雀巢高蛋白奶麦粉、铁锌钙营养米粉、鱼肉蔬菜营养米粉等），污水样本取自本地区湖水，污水需称量7ml，罐头10g（亨氏水果泥、蔬菜骨泥、三文鱼番茄罐头等）。

1.2 方法 采用LAMP技术、荧光定量PCR技术对检测样本中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌进行检测，比较两种检测方法的检测结果。

附表 LAMP与荧光定量PCR对各样本致病微生物的检测结果比较（n，%）

1.2.1 LAMP检测 试剂及仪器分别为DNA抽提试剂盒、化学试剂（包括MgSO4、NH4SO4、KCI溶液等）、凝胶电泳仪，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌各设计4条引物（即F3、B3、FIP、BIP），合成于上海生物工程公司；在消毒样品包装的开启和取样勺后，称取药品，加入蒸馏水90ml后混匀，并培养24h，将样品溶液置于肉汤中，混匀培养24h，随后取增菌液500μl置于无菌离心管，离心后弃上清液，加入80μl核酸提取液，沸水浴10min后冷却，再离心2min取上清液为后续反应模版，使用LAMP对上清液进行扩增，孵育1小时后在80℃下孵育5min，结束反应，设置对照。反应管内加入SYBR GreenI 1μl，混匀后于黑色背景下反应观察。阳性对照反应液为绿色、阴性为橘色，则检测结果有效，在此前提下样品反应液为绿色，则为阳性[2]。

1.2.2 荧光定量PCR检测 试剂及仪器分别为DNA抽提试剂盒、定量反应配套试剂盒、核酸蛋白分析仪、定量聚合酶链反应仪，金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌的引物设计采用Primer5.0引物设计软件进行设计，金黄色葡萄球菌引物正向、反向基因序列分别为CATTGGCCAAGCGAGACGAAC、AAAGGGCAAGACGCAAAGAGGT，大肠埃希菌引物正向、反向基因序列分别为TGATAGCTGCACTCGAATCC、GTAGCCTATAACGTCATGCC，沙门菌引物正向、反向基因序列分别为TCATGGGACCCTCATTGGATCC、GTGTTTTTCGCCACGAACGCCCAT；定量PCR扩增采用定量反应配套试剂盒，按照试剂盒说明书进行操作，扩增反应采用二步法进行，先在95℃下预变性反应10min，再在95℃下扩增20s，在60℃下反应1min，共反应40个循环，再采用DNA抽提试剂盒对细菌的总DNA进行提取，如凝胶电泳结果中可见各致病菌的目的条带即为阳性，反之则为阴性[3]。

1.3 统计学方法 采用SPSS19.0软件处理数据，计数资料（n,%）进行χ2检验，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LAMP检测结果 成功建立检测金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌的LAMP，说明LAMP对致病微生物的检测灵敏度较高；LAMP反应后肉眼可见明显绿色，凝胶电泳结果可见连续阶梯状条带（见附图1），说明其引物特异性均较为良好。

2.2 荧光定量PCR检测结果 成功建立检测金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌的荧光定量PCR，说明其对致病微生物的检测灵敏度较高；荧光定量PCR反应后凝胶电泳结果可见目的条带（金黄色葡萄球菌目的条带大小为484bp，大肠埃希菌目的条带大小为662bp，沙门菌目的条带大小为284bp），目的基因溶解曲线（见附图2），说明其引物特异性均较为良好。

2.3 LAMP与荧光定量PCR检测结果比较荧光定量PCR检测对三类样本中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌检出率均高于LAMP检测，但差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见附表。

3 讨论

食品微生物检验是食品安全检查的重要环节，通过对食品中的致病微生物进行检验，可有效检出食品中的致病微生物。食品中的致病微生物主要为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌，而采取何种检测技术对其有效检出尚有待探讨。

LAMP技术是近年来在食源性致病微生物检测中应用较多的一种技术，主要是利用特殊性能的DNA聚合酶设计引物，引物在靶序列DNA区可进行杂交，合成互补链，进而生成DNA产物，通过肉眼可对结果进行判定，同时，由于LAMP反应条件仅需60℃恒温条件，无需特殊的仪器设备，仅需温度循环仪器设备即可，其操作较为便利，结果判读较为方便[4]。荧光定量PCR技术是一种新型的微生物检验技术，在食品微生物检验中应用广泛，由于部分病原微生物具有高度变异性，在检验过程中容易出现假阳性，而荧光定量PCR技术可对病原微生物进行定量检测，从而可有效规避其假阳性结果，检测准确性较高[5]。本次研究中，LAMP、荧光定量PCR均成功建立金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌检测，说明二者对致病微生物的检测灵敏度较高，且LAMP反应后可见明显浑浊或沉淀，荧光定量PCR反应后可见目的基因溶解曲线呈单一曲线，说明二者引物的特异性均较为良好。此外，本次研究还发现，荧光定量PCR检测对三类样本中的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌检出率均高于LAMP检测，但差异均无统计学意义（P＞0.05），这提示我们这两种检测技术均具有较高的准确性，可将二者结合进行检测。

综上所述，LAMP技术、荧光定量PCR技术用于食品中致病微生物检测均具有良好的检测效果，具有其各自优势，在实际工作中，应将二者结合进行联合检测，以提高食品中致病微生物的检出率，促进食品安全。