洛伐他汀含量测定（高效液相色谱法）超声波样品处理方法验证

2018-10-19北京北大维信生物科技有限公司100094石海清周守岫王晓峰

首都食品与医药 2018年5期

北京北大维信生物科技有限公司（100094）石海清周守岫王晓峰

《中国药典》2015年版四部规定洛伐他汀含量测定（高效液相色谱法）的测定方法，适用于本公司红曲的洛伐他汀含量测定，此产品的含量测定前，样品使用超声波样品处理方法进行处理；用使用因子（影响样品处理质量的过程变量：温度、超声水位、样品装载量、样品）设计试验，对红曲样品洛伐他汀含量测定中在超声水槽中的位置进行调查，确定影响样品处理的因素，并通过验证确定该方法中超声波样品处理的影响因素和最佳条件，以保证样品处理方法用于洛伐他汀含量测定时，能够有效地控制上样前样品的质量，从而确定本公司实验室的样品处理的影响因素及样品处理的最佳条件。

1 风险评估

1.1 为了保证本实验室红曲样品洛伐他汀含量测定（高效液相色谱法）超声波处理方法的处理质量，规避或将风险控制在可接受范围内，进行风险评估。红曲样品处理方法为超声处理1小时。

1.2 以风险得分RPN为评估原则。使用FMEA法进行风险评价的原则，以风险得分RPN为评估依据。RPN由可能性得分、严重性得分、可检测性得分相乘得到，即：风险得分RPN=可能性得分×严重性得分×可检测性得分。风险得分（RPN）分值越高，风险越大；分值越低，风险越小。风险按高低分为：高级风险H：风险得分12～27，此风险必须降低。中级风险M：风险得分8～9，此风险必须降低至尽可能低。低级风险L：风险得分3～6，此风险必须降低至尽可能低。微小风险S：风险得分1～2，通常可以接受的风险。见附表1。

通过风险分析，需对该方法进行方法学验证。通过系统地调查影响样品处理质量的过程变量，确定影响样品处理质量的过程条件，有针对性地进行设备改进，并将样品处理条件实现最优化，以增强样品处理的的可靠性、质量和重现性。

2 仪器设备、试验用具和试剂试液

仪器设备：高效液相色谱仪、超声波清洗器、电子天平、离心机。试验用具：移液管、容量瓶。试剂试液：洛伐他汀对照品、甲醇、中性氧化铝。

3 对照品与供试品制备

3.1 对照品溶液的制备精密称取洛伐他汀对照品10mg，置50ml量瓶中，加甲醇适量使溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5ml，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1ml中含洛伐他汀40μg）。对照品溶液需制备2份平行溶液。

3.2 供试品溶液的制备取供试品，混匀，研细，精密称定，红曲1.0g，置15ml具塞离心管中，精密加75%乙醇10ml，密塞，摇匀，称定重量，超声处理（60分钟，功率250W，频率28kHz）取出，放冷，再称定重量，用75%乙醇补充减失的重量（减失重量小于0.05g不需要补重），摇匀，离心（10分钟，2000转/分钟）。精密量取上清液3ml，置25ml量瓶中定容，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.3 测定对照品溶液与供试品溶液进样量均为10μl，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。

3.4 计算公式计算公式1：对照品响应因子F=Cr /Ar；计算公式2：对照品平均响应因子；计算公式3：对照品响应因子的相对偏差；计算公式4：含量Cx=(供试品峰面积Ax×/称样量m)×10×25/3000。

4 验证过程

4.1 红曲样品洛伐他汀含量测定测定方法：使用一般全因子设计（1/2）对红曲样品洛伐他汀含量测定中影响样品处理质量的过程变量：温度、超声水位、样品装载量、样品在超声水槽中的位置进行调查，每种过程变量使用2～3个设置条件，由此形成正交实验表。按实验表列明的条件进行同一个红曲样品处理并进行洛伐他汀含量测定，测定结果使用MINITAB（版本17）进行方差分析，确定影响样品处理质量的过程条件。样品洛伐他汀含量测定结果见附表2。

4.2 结果处理方法与数据分析标准

4.2.1 结果处理对洛伐他汀含量测定结果使用MINITAB（版本17）进行方差分析，以对样品处理条件中对结果影响显著的条件应进行筛选。筛选出结果影响显著的因子进一步筛选条件。筛选出结果影响显著的连续因子条件作为因子进行一般全因子设计（2个重复），利用响应优化挑选洛伐他汀含量测定结果最高的一组条件相应水平作为相应样品的最佳样品处理条件。

4.2.2 结论及判定符合“结果处理”中优选条件的样品处理方法建议作为样品处理条件。“结果处理”中与优选条件的洛伐他汀含量均值相差2.0%之内的条件对样品测定影响很小，亦可判定为符合要求的样品处理条件。如上述2项均不能筛选出满足的样品处理条件，应改变影响因素的种类和水平重新验证。

4.2.3 数据分析对方案形成的正交实验表，测定结果使用MINITAB（版本17）进行方差分析，确定影响样品处理质量的过程条件，详见附表3。

4.2.4 从检验结果可以看出，红曲（干）洛伐他汀含量测定结果不受温度、水位、样品装载、样品位置影响（P值大于显著性水平0.05）。

综上，通过检测结果可见，红曲（干）洛伐他汀含量测定洛伐他汀含量测定的温度、水位、样品装载、样品位置条件如附表4。