两种促渗方式对虫草素的透皮影响的实验研究

王雪艳，黄艳萍，杨 莹，许剑怡，王宏娟，唐旭东*

（1.深圳清华大学研究院创新中药及天然药物研究重点实验室，深圳，广东，5518000 2. 深圳清华大学研究院-华研共建皮肤健康研究中心，深圳，广东，518000）

虫草素（3’-脱氧腺苷）是一种具有多种生物学功能的核苷类抗菌素[1]，具有明确的抗微生物[2]、抗肿瘤、抗突变、抗转移[3]、抗血管生成、抗真菌、抗糖尿 病、抗 炎、抗 血 小板凝集[4]、免疫调节、降血糖等作用[5]。最近研究成果表明：虫草素通过调节泌乳素分泌，参与调节细胞增殖与分化、毛囊周期、免疫应答等生理过程，从而产生干预系统性红斑狼疮、系统性硬皮病、白塞病、干燥综合症、银屑病等免疫相关皮肤病的作用[6,7]，在皮肤病药物外用制剂、功效性化妆品等应用开发领域，是明确地具有开发前景的一类化合物。

透皮给药系统是指使药物以一定的速率通过皮肤，经毛细血管吸收，进入人体循环而达到产生药效的一类制剂，与传统给药方式相比，具有避免肝脏“首过效应”的优点。但由于皮肤角质层的阻碍，药物难以透过皮肤发挥治疗作用。因此根据药物特征，促渗技术的筛选和优化，是透皮给药系统研究的重点领域，常见促渗技术有：化学促渗、微针、皮下注射、无针注射、离子导入、超声波、电致孔等[8]。

本文采用Franz透皮给药系统，考察微针和化学促渗剂两种促渗方式，对促进虫草素透过角质层的影响，计算单位面积累积渗透量Qn、稳态渗透常数Jass、建立渗透模型，为含有虫草素的外用制剂（例如药物外用制剂、功能性化妆品）等的开发，特别是给药形式等，提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及主要试剂、仪器

雄性SD 大鼠，体重180-200g，6 周龄，中国人民解放军医学科学院实验动物中心，实验动物使用许可证号：SCXK2015-0001

虫草素对照品( 批号10040422 上海源叶生物科技有限公司; 虫草素( HPLC纯度＞ 98%，本室合成) ; 甲醇(色谱纯，BCR)；氮酮（药用级，阿拉丁）；醋酸( Fisher Chemicals)；SA-2100E1制水机（日本EYEle）；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠( 国药集团化学试剂有限公司，分析纯)

TT-6(D)透皮扩散试验仪(天津市正通科技有限公司)；岛津20A高效液相色谱仪（日本岛津）；SCQ-超声波清洗器( 上海声彦超声波仪器有限公司)；AG-135型电子分析天平( 瑞士Mettler-Toledo)；DL-Z 型纳米晶片(高度为150 μm ,苏州纳通生物纳米技术有限公司）

1.2 方 法

1.2.1 虫草素方法学考察 色谱条件：色谱柱TC-C18（4.6×250mm，5μm），流动相甲醇：水=20:80，柱温30℃，流速1.0ml/min，检测波长，进样量 10μL。

标准曲线：取虫草素对照品5 mg，精密称定，置50 mL 棕色量瓶中，用磷酸盐缓冲液( PBS，pH 7.4) 超声至溶解，并稀释至刻度，即得浓度为100 mg/L的虫草素对照品储备液。精密量取一定量的对照品储备液，用PBS稀释为系列浓度对照品溶液（0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0 mg/L）。对照品溶液10μL进样，以浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，建立回归方程，并考察线性范围。

精密度：取1.0 mg/L 的虫草素对照品溶液，采用1.2.1项下色谱条件重复进样6次，进样量10μL，计算峰面积相对标准偏差RSD。

稳定性：取1.0mg/L的虫草素对照品溶液，采用1.2.1项下色谱条件，分别在0，4，8，12，16，24h进样，进样量10μL，计算峰面积相对标准偏差RSD。

回收率：取已知浓度的12 h 空白对照组透皮接收液0.5mL，分别精密加入1.0 mg/L的虫草素对照品溶液，充分混匀后，平行制备6份，采用1.2.1项下色谱条件，进样量10μL，计算平均回收率。

1.2.2 体外透皮实验 离体鼠皮制备：大鼠处死后，取腹部皮肤，刮去鼠毛并除去脂肪等，生理盐水清洁，分割成大小相等的小块，冷藏备用（过程中注意保留完整角质层）。

微针预处理：平铺1.2.2项下制备的鼠皮，角质层朝上，用150μm的微针在1 N 的压力下垂直作用于鼠皮，按压微针顺皮肤纹理滞留1 min 后移走，鼠皮冷藏备用。

透皮实验：将大小相等的鼠皮和微针预处理后鼠皮，分别固定在渗透扩散装置的扩散池与接收池之间，角质层面向扩散池，真皮层面向接收池，在接收池中注入接收液 ( PBS，pH7.4) 约7 mL，在扩散池分别加入空白溶液（PBS溶剂）、虫草素组（500mg/mL，PBS溶剂）、 微针预处理组（虫草素浓度500mg/mL，PBS溶剂，微针预处理鼠皮）、氮酮组（虫草素浓度500mg/mL，0.2%氮酮，PBS溶剂），水浴37℃，磁力转子恒速300r/min。分别于0.5、1、2、4、8、12、24h取样，取样量0.5ml。取样后，补加接收液至刻度。样品按2.1.1项下方法测定虫草素含量。

1.3 计 算

采用公式1,计算单位面积累积渗透量。以单位面积累积渗透量(Q,μg/cm2) 对渗透时间t进行线性拟合，取得渗透动力学公式，

其中：曲线斜率为稳态渗透速率常数（J，μg/cm2·h）、微针或渗透剂处理后与未处理药物在24h内的透皮速率常数之比为增渗倍数（ER），曲线与t轴交点为滞后时间（Tlag，h）

实验数据采用SPSS statistic 17.0统计软件处理。两两之间的比较采用t 检验，P＜0.01认为有显著性差异。

图1 虫草素液相色谱图

图2 虫草素单位面积渗透累积量曲线

公式中，Qn为第n个取样点的单位面积渗透量，A 为有效经皮吸收面积，V 为接受液体积， V0 为取样体积，Cn 为第 n 个取样点测得的接受液中虫草素浓度，Ci 为第 i个取样点测得的接受液中虫草素浓度( i≤n-1) 。

2 结 果

2.1 虫草素含量测定方法学考察结果

虫草素液相色谱图如图1所示。系列浓度虫草素对照品浓度C对峰面积A作图，线性回归方程为A = 55.624C- 6.109（R2=0.9999），线性范围0.100-28. 8 mg/L，线性关系良好；精密度RSD为0.278（n=6）；24h内稳定性RSD为0.334（n=6）；平均回收率为98.72%，RSD为0.38%（n=6）。该方法仪器精密度符合要求，稳定性良好，回收率达到标准，可用于虫草素的含量测定。

2.2 两种促渗方式对虫草素透皮单位面积累积渗透量的影响

对比微针组、氮酮组、虫草素组24h内，透皮的单位面积累积渗透量结果如表1所示。结果表明：微针处理组、氮酮组后，从0.5h-24h，单时间点单位面积累积渗透量均高于虫草素组，且均存在显著性差异量（P＜0.01）。两种促渗方式，存在组建差异（P＜0.05），但差异不显著。虫草素单位面积累积渗透量值如表1所示。

2.3 两种促渗方式促进虫草素透皮模型研究

取24h内，渗透时间(t)对虫草素的单位面积累积渗透量(Q)进行拟合，如图2所示。结果表明：单位面积累积渗透量与时间呈线性关系，符合零级动力学。稳态渗透速率常数J如表2所示。微针组和促渗剂组与虫草素组相比，增渗倍数分别为1.916及1.720；三组的滞后时间分别为0.248 6、0.445 0、0.166 9h。

表1 虫草素单位面积累积渗透量(n=3)

表2 两种促渗方式的透皮模型考察

3 讨 论

微针预处理和促渗剂（0.2%氮酮）均能显著促进虫草素透皮吸收（P＜0.01），透皮行为均为零级动力学模型。两组间存在差异，差异不显著（P＜0.05），但单点微针预处理组均优于促渗剂组。

氮酮透皮的原理主要为（1）促进药物经表皮细胞间隙和毛囊途径；（2）与角质细胞内基质相互作用，液化细胞内脂质使扩散阻力降低；（3）增加皮肤角质层含水量，增加药物在角质层储库，促进水溶性物质经水性通道渗透[9]。目前，以氮酮为代表的化学促渗剂烃、酮、酰胺和亚砜等有机化合物，在药品、化妆品中应用已非常广泛，其易渗透进入皮肤，但存在皮肤刺激和炎症反应。研究表明氮酮对小鼠皮肤有刺激作用，还可与某些物质形成络合物，影响药物作用，且凡士林和液体石蜡等疏水性介质对其活性有影响[10-12]。

微针透皮能有效促进药物的皮肤渗透，具有皮下注射和透皮给药的双重优势，可以通过微针物理性刺穿皮肤的角质层，形成微小通道，具有显著的促渗效果，同时不产生痛感，近年来已广泛应用于各类药物及高档化妆品中[13-14]。与促渗剂比较，微针不与药物及介质发生反应，也不一产生皮肤刺激和炎症反应，且可以通过调节微针长度和预处理方式（压力、作用时间等）控制通道的大小和深度，进而影响渗透效率，有利于个性化给药。

针对虫草素透皮，微针预处理和氮酮均能达到显著促进渗透的作用，且微针略好于氮酮，但由于机理方面的显著差别，因而使用具有明显的特点：前者皮肤刺激性小，且可以个性化控制，但需要借助额外的工具（晶片微针等）；后者使用方面，但可能会带来皮肤刺激作用。因此，针对含有虫草素的药物外用制剂、化妆品的应用开发方面，建议根据具体使用场景予以选择，发挥最大功效。