郫县豆瓣的营养、多酚含量与抗氧化活性评价

袁旭，伍小宇，李伟丽，王庆慧，刘平，林洪斌，车振明，吴韬

(西华大学 食品与生物工程学院，四川 成都，610039)

郫县豆瓣主产于四川省成都市郫都区(原郫县)，是中国地理标志产品。它以红辣椒、蚕豆、小麦粉为主要原料，通过微生物制曲、前发酵，再经过翻、晒、露等后发酵工艺酿制而成，其制作技艺已经列入国家级非物质文化遗产名录[1]。郫县豆瓣具有色泽红褐油润、瓣粒香脆、味鲜辣及酱酯香等特点，是川菜食谱中最常用的调味品之一，被誉为“川菜之魂”。

以往研究表明，发酵调味品不仅具有独特的感官特征，还具有显著的生理活性。例如日本纳豆是以大豆为原料，经过纳豆芽孢杆菌发酵后制成，具有抗癌、溶解血栓、降血压、抗氧化、抗菌等多种生物活性[2]。尽管郫县豆瓣距今已有300多年的历史，对它的研究还主要集中在发酵菌群、风味成分、辣度及生产工艺等方面，而对其营养成分及功能活性研究极少。在国标GB/T 20560—2006《地理标志产品郫县豆瓣》中，仅针对郫县豆瓣的水分、氨基酸态氮、总酸、食用盐、酸价及过氧化值这些理化指标提出了规范要求[3]。多酚是一类广泛存在于植物体内的具有多元酚羟基结构的次生代谢物，包括酚酸、黄酮、单宁等化合物。其结构中的邻位酚对活性氧等自由基具有很强的捕捉能力, 这使得多酚类成分通常具有较强的抗氧化性以及清除自由基的能力。近年来许多学者亦认为经常摄入含有植物多酚的食物，与降低癌症、心血管疾病、关节炎等慢性病的发病率具有密切相关性[4]。

随着我国经济水平的日益提高，人们对调味品的要求已不再仅限于吃饱吃好，而是将风味、营养与预防疾病等需求统一联系起来。本文拟通过对市场上郫县豆瓣酱的营养、多酚类成分及抗氧化活性进行初步评价，以期为今后郫县豆瓣酱工艺改进，标准提高及相关功能食品开发等提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

10种不同品牌郫县豆瓣酱2017年5月购于成都超市。没食子酸、抗坏血酸、芦丁、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、三吡啶三吖嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ)，美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

K1100型全自动凯氏定氮仪、SOX406型脂肪测定仪，山东海能科学仪器有限公司；SpectraMax i3x多功能酶标仪，奥地利Molecular Devices公司；TD-5M型离心机，四川蜀科仪器有限公司；万能高速粉碎机，深圳尼嘉商贸有限公司；Heto-HSC500真空冷冻干燥机，上海佰蕾真生物科技有限公司；DHG-9075A型电热恒温鼓风干燥箱，上海一恒科技仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品制备

取50 g供试样品置于-50 ℃真空冷冻干燥机24 h，干燥后用高速粉碎机将豆瓣粉碎，盛装在洁净密封袋中，备用。

1.3.2 化学成分测定

1.3.2.1 脂肪的测定[5]

所有样品脂肪含量的测定均按GB/T 5009.6—2003规定的方法，采用索氏抽提法。

1.3.2.2 蛋白质测定[6]

所有样品蛋白质含量的测定均按GB/T 5009.5—2010《食品中蛋白质的测定》规定的方法，采用凯氏定氮法。

1.3.2.3 灰分测定[7]

所有样品灰分含量的测定均按GB 5009.4—2016规定的方法，采用灼烧法。

1.3.3 样品提取液制备[8]

称取待测豆瓣样品粉末2 g加入20 mL体积分数为60%的乙醇溶液，于50 ℃、70 W超声波提取30 min，4 000 r/min离心15 min，取上层清液5 mL过0.45 μm滤膜，滤液待测。

1.3.4 总黄酮含量的测定[9]

采用AlCl3-NaOH-NaNO2法测定样品中总黄酮的含量。取50 μL样品提取液与20 μL 0.5 mol/L NaNO2溶液于96微孔板中，室温孵育5 min后，加入20 μL 0.3 mol/L AlCl3·6H2O溶液室温旋转孵育6 min，加入200 μL 0.5 mol/L NaOH溶液旋转混合均匀，于波长510 nm处测吸光度，读数前摇动微孔板30 s。以芦丁为标准品(0～0.5 mg/mL)绘制标准曲线(y=0.046 22+1.428 83x，R2=0.999 11)。结果以毫克芦丁当量每克干物质计(mg芦丁当量/g)。

1.3.5 总多酚含量的测定[10]

采用Folin-Ciocalteu法测定样品中的总多酚含量。取25 μL样品与125 μL 质量分数10%的福林酚试剂于96微孔板中，轻轻旋转微孔板使其混匀，静置8～10 min，然后加入125 μL 质量分数7.5%的Na2CO3溶液，避光反应30 min，于波长765 nm处测吸光度。以没食子酸为标准品(0～300 mg/L)绘制标准曲线(y=0.111 94+0.006 66x，R2=0.998 63)，结果以毫克没食子酸当量每克干物质计(mg GAE/g)。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的测定[11]

用体积分数60%的乙醇溶液将样品提取液分别按2、4、8、16、32倍进行稀释。吸取50 μL稀释后的样品与200 μL 0.5 mmol/L新鲜配制的DPPH溶液(60%乙醇)于96微孔板中，在酶标仪上振荡10 s混匀，室温避光反应30 min，于波长517 nm处测吸光度。以水溶性抗坏血酸(0.062 5～1.0 mmol/L)为标准品绘制标准曲线。DPPH自由基清除能力按下列公式计算：

(1)

式中：ACDPPH，DPPH自由基清除能力，%；Aa，DPPH与体积分数60%的乙醇混合液的吸光度；Ab，60%乙醇与样品混合液的吸光度；As，DPPH与样品混合液的吸光度。

1.3.7 还原能力的测定[12]

采用铁离子还原能力(Ferric reducing antioxidant power，FRAP)法测定不同样品提取液中总抗氧化能力。配制10 mmol/L TPTZ溶液：称取0.031 23 g TPTZ，用40 mmol/L盐酸溶液定容至10 mL；配制FRAP工作液：由0.3 mol/L pH 3.6醋酸缓冲液，20 mmol/L三氯化铁溶液和10 mmol/L TPTZ溶液按10∶1∶1(体积比)组成，临用前混合。取100 μL样品于反应管中，加入3 mL FRAP工作液，混匀后置于37 ℃水浴10 min，分别吸取200 μL 混合液于96微孔板中，于波长593 nm处测吸光度。以水溶性抗坏血酸(0.062 5～1.0 mmol/L)为标准品绘制标准曲线(y=0.072 06+0.000 65x，R2=0.999 64)，结果以微摩尔水溶性抗坏血酸当量每克干物质计(μmol VC/g)。

1.4 数据处理

2 结果与分析

2.1 营养成分含量分析

在微生物发酵过程中，豆瓣原料中的一些蛋白会被降解，而有些新蛋白会被合成。因此豆瓣酱中蛋白质含量是原料中蛋白质总量与微生物代谢总量的综合反映。由表1可以看出，不同品牌豆瓣酱的蛋白质含量的变化为5.14%～16.98%，除2号与6号样品之间无显著差异外(p>0.05)，其余豆瓣酱样品蛋白质含量均存在显著性差异(p<0.05)。

表1 不同品牌豆瓣酱中脂肪、蛋白质、灰分含量Table 1 Fat, protein and ash contents in differentbean pastes

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

豆瓣酱中的脂肪主要来源于原料中的蚕豆、辣椒和面粉，以及外加的辣椒红油。其脂肪含量的变化为2.26%～23.51%。除了8号与9号、4号与5号、2号与3号之间无显著性差异外(p>0.05)，其余均有显著性差异(p<0.05)，此外，红油豆瓣(1～7号样品)脂肪含量显著高于老豆瓣(8～10号样品)，这是因为红油豆瓣在工艺中加入了辣椒红油。

灰分是标示食品中无机成分总量的一项指标。由表1可以看出郫县豆瓣酱中的灰分含量的变化为3.74%～4.81%，除1号和2号，3、9和10号样品之间无显著性差异外(p>0.05)，其余均有显著性差异(p<0.05)，所有样品的灰分含量均在3%以上，主要来源于生产过程中加入的食盐以及豆瓣酱原料中的无机盐等。

2.2 总多酚、总黄酮含量分析

豆瓣酱的总多酚含量的范围为2.290～5.385 mg没食子酸当量/g，其含量最高值约为最低值的2.4倍。总黄酮含量的范围为0.660～2.298 mg芦丁当量/g，其含量最高值约为最低值的3.5倍。

2.3 抗氧化活性评价

2.3.1 DPPH自由基清除能力评价

分别配制不同浓度的豆瓣样品，并测定其对DPPH自由基的清除率，根据每个样品不同浓度对DPPH自由基清除率，绘制DPPH自由基清除能力曲线图(图1)。ICDPPH 50值表示降低DPPH初始吸光度值50%所需的样品的浓度(mg/L)，ICDPPH 50值越小，表示其清除自由基的能力越强，即抗氧化活性越强。由图1可知，同一豆瓣酱样品随着提取物浓度的增大，其DPPH自由基清除能力逐渐增大。除10号与7号、9号，2号与6号的ICDPPH 50值之间无显著差异外(p>0.05)，其余均有显著性差异(p<0.05)。本实验以天然抗氧化剂水溶性VC作为对照，其ICDPPH50值为4.724×10-3mg/mL，而不同品牌豆瓣酱ICDPPH50值最小值为7.662 mg/mL，表明各样品的清除自由基的能力均显著弱于Vc，不同品牌抗氧化能力由大到小依次为：7号、10号、9号、1号、6号、2号、3号、8号、5号和4号。

图1 不同浓度豆瓣酱提取物对DPPH自由基的清除效果Fig.1 DPPH free radical scavenging effects of extracts various concentrations from bean paste

2.3.2 还原能力评价

由表2可知，豆瓣酱的FRAP值(氧化铁还原能力)的变化范围为11.474～45.967 μmol VC/g，除了4号、5号与3号、6号，8号与6号，7号、1号与3号、10号，9号与3号无显著性差异(p>0.05)外，其余均有显著性差异(p<0.05)。FRAP值越大，其抗氧化性越强，因此10种品牌豆瓣酱抗氧化能力由大到小依次为：10号、1号、7号、3号、9号、2号、5号、4号、6号、8号。

表2 豆瓣酱提取物中总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性Table 2 Total polyphenol and flavonoid contents and antioxidant activities of extracts from bean paste

续表2

试验号总黄酮含量/(mg芦丁·g-1)总多酚含量/(mg GAE·g-1)ICDPPH 50值/(mg·mL-1)FRAP值/(μmol VC·g-1)72.298±0.127g5.385±0.140f7.662±0.248a40.694±4.204ef80.823±0.155ab2.290±0.128a32.766±1.248f11.474±1.018a92.141±0.122fg5.211±0.166f10.851±0.888b30.797±3.985d102.046±0.184f5.128±0.115f9.396±0.274ab45.967±6.376f

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

2.4 总多酚、总黄酮含量与抗氧化活性的相关性分析

为比较豆瓣中总黄酮、总多酚含量与其抗氧化关系，采用Pearson′s方法进行相关分析，由于ICDPPH 50值越小，表示其抗氧化活性越强，因此采用ICDPPH 50倒数值进行相关性分析。结果如表3所示，总黄酮、总多酚含量与DPPH自由基清除能力之间呈显著正相关，与还原能力之间呈极显著相关，其中总黄酮含量与DPPH自由基清除能力、还原能力之间的相关系数r分别为0.727和0.867；相关性分析显示，还原能力与总黄酮含量和总多酚含量均具有较好的相关性，相关系数r分别为0.867和0.866；DPPH自由基清除能力与总黄酮、总多酚含量的相关性系数r分别为0.727和0.714，以上数据表明多酚、黄酮类物质是豆瓣酱中主要的抗氧化剂。

表3 不同品牌豆瓣酱提取物的总黄酮、总多酚含量 与抗氧化活性相关性分析Table 3 Correlation analysis between total phenolic and flavonoid contents and antioxidant activities from different extracts of bean pastes

注：*显著相关(p<0.05)；**极显著相关(p<0.01)。

3 讨论

3.1 不同品牌郫县豆瓣酱营养成分之间差异

本研究发现不同品牌的郫县豆瓣酱的蛋白质、脂肪含量差异极显著，例如4号样品的蛋白质含量仅为10号样品的42%，而脂肪含量是10号的3.4倍。这种显著差异一方面在于原料成分存在差异，另一方面可能在于这2种豆瓣酱的制造工艺不同。10号样品为采用传统工艺加工的豆瓣酱，发酵周期在1年以上，俗称老豆瓣。而4号样品为红油豆瓣酱，其发酵工艺与传统工艺类似，但是发酵周期较短，一般仅为3个月。此外，红油豆瓣酱还会加入植物油进行封存。目前国标GB/T 20560—2006及第1号修改单虽然提到豆瓣酱可以加入植物油封存，但未对郫县豆瓣的加油量进行规定，因而不同品牌的红油豆瓣的加油量可能存在较大差异，进而会对郫县豆瓣的营养成分产生显著影响。本研究首次对郫县豆瓣的营养成分进行评估，为今后豆瓣质量标准改进与提升奠定了基础。

3.2 郫县豆瓣的多酚和黄酮含量与抗氧化活性之间的关系

本研究采用DPPH自由基清除方法，FRAP总抗氧化能力方法评价了不同豆瓣的抗氧化活性，2种方法采用了抗坏血酸作为参照，为不同研究结果之间进行比较提供了参考。此外总黄酮、总多酚含量与DPPH自由基清除能力之间呈显著正相关(r分别为0.727、0.714)，与FRAP总抗氧化能力之间呈极显著相关(r分别为0.867、0.866)，表明多酚、黄酮类物质可能是豆瓣酱中主要的抗氧化成分。

4 结论

本研究首次针对郫县豆瓣酱的营养成分(蛋白质、脂肪、灰分)、功能成分(总多酚、总黄酮)含量以及体外抗氧化活性进行评价。研究结果表明，不同品牌豆瓣酱中的蛋白质、脂肪、灰分的含量存在显著差异，其不仅与原料有关，还可能与郫县豆瓣加工工艺有关。此外郫县豆瓣具有显著的抗氧化活性，多酚、黄酮类物质可能是豆瓣酱中主要的抗氧化物质。未来还需要采用分离纯化手段进一步明确郫县豆瓣的多酚、黄酮类物质的详细组成。本文为今后郫县豆瓣酱工艺改进，郫县豆瓣相关功能食品开发等提供理论支持。