白酒难挥发组分中呈苦味三羟基十八烯酸的分离与鉴定

赵腾飞，陈双，李华钟，徐岩

(江南大学，食品科学与技术国家重点实验室，工业生物技术教育部重点实验室，生物工程学院酿酒微生物与酶技术研究室，江苏 无锡 214122)

白酒是我国独具民族特色的蒸馏酒，其固态蒸馏的生产工艺不仅赋予白酒复杂的挥发性组分[1]，同时也能够将酒醅中分子量较大的难挥发组分夹带至酒体中[2-3]。丰富的挥发性组分和难挥发组分共同构成了白酒的独特风味。

早期对白酒中化学成分的研究主要集中于挥发性组分的解析，通过气相色谱-质谱和全二维气相色谱-飞行时间质谱等技术的应用，在白酒中已鉴定出超过1 000种挥发性组分[4]。而基于气相色谱-闻香技术的应用，进一步明晰了这些挥发性组分在白酒中的风味功能。目前已在不同香型白酒中鉴定出超过400种具有香气功能的化合物，基本解析了不同香型白酒的关键风味特征[5-7]。随着研究的深入，对白酒的探索逐渐从挥发性组分扩展至难挥发组分。郑伟等人通过衍生化结合气相色谱-质谱首次分析了酱香、浓香和清香三大香型酒样的难挥发化合物，共鉴定出16种醇、23种有机酸、16种酯和9种糖等化合物，并指出酱香型酒样的难挥发组分最为复杂。但在该研究中，仍有大量色谱峰未能准确定性[3]。杨会等人同样使用衍生化结合气相色谱-质谱的方法针对白酒中的难挥发有机酸进行了分析，共定性定量了27种有机酸[8]。张荣等人通过制备液相色谱结合核磁共振技术，首次在白酒中分离鉴定出分子质量>1 000 u的脂肽类化合物[2]。这些研究表明白酒中存在丰富的难挥发组分，但由于难挥发组分中化合物的多样性和结构复杂性，对难挥发化合物的分离鉴定及风味功能研究存在很大的挑战。

白酒作为嗜好性酒精饮品，味觉和口感是决定其风味质量和消费者偏好的重要指标。一般而言，大多数呈味物质具有难挥发性[9-10]，然而在白酒难挥发组分中，有关呈味化合物的分析却鲜有报道。针对复杂食品基质中具有呈味功能化合物的研究，德国HOFMANN教授团队建立了一套基于滋味稀释技术的分析方法(taste dilution analysis，TDA)[11]，它能准确且高效地鉴定食品中的关键呈味物质。TDA方法主要原理是以人们的口腔感知为导向，结合高效液相色谱、凝胶色谱和高速逆流色谱等分离技术，从食品呈味组分中分离出关键呈味化合物，进一步通过傅里叶红外光谱、高分辨质谱和核磁共振等技术对关键呈味化合物的结构进行鉴定。该方法已经成功的鉴定出啤酒中[12]、清酒中的苦味化合物[13]和葡萄酒中的酸涩味化合物[14]等。

因此本研究针对白酒基质，基于TDA技术建立白酒难挥发组分中呈味组分的提取分离和鉴定方法，解析白酒难挥发组分中具有呈味功能的化合物，有助于丰富对白酒中呈味物质的认识。

1 材料与方法

1.1 实验试剂

甲醇、乙醇和甲酸均为色谱纯，购买于Adamas-beta(中国上海)；2-羟基丙酸(CAS：50-21-5)和2-羟基-4-甲基戊酸(CAS：498-36-2)购买于Sigma-Aldrich(中国上海)；9,10,13-三羟基-11(E)-十八烯酸(CAS：29907-57-1)和9,12,13-三羟基-10(E)-十八烯酸(CAS: 29907-56-0)购买于Larodan Fine Chemicals(瑞典)；瓶装水(中国杭州，哇哈哈)，用于感官品评；去离子水为Milli-Q超纯水，用于仪器分离。实验中所用5%乙醇水溶液和1%甲酸水溶液中的百分数均指体积分数。

1.2 白酒样品

酱香型白酒(酱香1，53%(vol)，由贵州某酒厂提供)，用于呈味物质的分离鉴定。酱香型酒样[酱香2，53%(vol)]、浓香型酒样[浓香1、浓香2，52%(vol)]和清香型酒样[清香1、清香2，52%(vol)]均为市售成品白酒，用于呈味物质含量分析。所有酒样都储存于4 ℃以待分析。

1.3 实验仪器

旋转蒸发仪(瑞士，Buchi)；冷冻干燥仪(美国，Labconco Corporation，4.5 L)；液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography，日本，Shimadzu，LC-20A)；超高效液相色谱仪-三重四极杆质谱仪(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS，美国，Waters，XEVO)；高分辨质谱仪(high resolution mass spectrometry，HRMS，美国，Thermo Fisher，Q Exactive)；核磁共振仪(nuclear magnetic resonance，NMR，德国，Bruker，AVANCE III)。

1.4 实验方法

1.4.1 难挥发组分的收集

使用旋转蒸发仪对白酒样品进行分离(具体使用的酒样量分别在结果与分析中列出)，旋转蒸发仪水浴温度为40 ℃，真空度-0.1 MPa。当蒸发瓶中的酒样<10 mL时，停止蒸发，收集难挥发组分。使用冷冻干燥仪器对难挥发组分进行冻干处理，将冻干后的样品储存于-20 ℃以待分析。

1.4.2 难挥发组分的固相萃取分离

将难挥发组分溶解至5%乙醇水溶液中，稀释后装载至C18固相萃取柱(柱体积60 mL，填料10 g；上海，安谱)。收集不被柱子保留的组分(F1)，被柱子保留的组分依次使用20%、40%、60%、80%和100%的甲醇水溶液进行洗脱，收集相对应的组分(F2～F6)。所有组分进行去溶剂冻干处理，并储存于-20 ℃以待分析。

1.4.3 HPLC分离

将得到的组分F4溶解于甲醇，组分F1溶解于水溶液。使用HPLC分别对它们进行分离。流动相为1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速为2 mL/min，紫外吸收波长225 nm。组分F4的洗脱梯度：Water C18色谱柱(5 μm，10 mm×250 mm)，0 min，A/B(70∶30)，3 min，A/B(70∶30)，40 min，A/B(0∶100)，45 min，A/B(0∶100)。组分F1的洗脱梯度：Waters苯基色谱柱(5 μm，10 mm×250 mm)，0 min，A/B(95∶5)，10 min，A/B(95∶5)，12 min，A/B(80∶20)，15 min(80∶20)。按照色谱峰将组分F4和F1分成若干亚组分，收集这些亚组分并对其进行去溶剂和冻干处理，之后储存于-20 ℃以待分析。

将组分F4-7溶解于甲醇，使用Waters苯基柱将组分F4-7继续分离，流动相为含1%的甲酸水溶液(A)和甲醇(B)，流速为2 mL/min，紫外吸收波长225 nm。洗脱梯度：0 min，A/B(55∶45)，35 min，A/B(45∶55)，40 min，A/B(0∶100)，45 min，A/B(0∶100)。按照色谱峰将组分F4-7再次分成若干亚组分，收集这些亚组分并对其进行去溶剂和冻干处理，之后储存于-20 ℃以待分析。

1.4.4 TDA分析

具体TDA实验方法参考文献[11]，将2 L酒样酱香1的难挥发组分通过HPLC分离，收集得到的组分，冻干后，溶解至2 mL 5%乙醇水溶液中，按照1∶1(体积比)的比例逐步用5%乙醇水溶液稀释。每个组分按照稀释倍数从高至低分配至感官品评人员进行品评，每个稀释倍数的溶液都需要进行三点检验。当品评人员刚好能分辨出某个稀释水平与其它两个空白样品中(5%乙醇水溶液)的差异时，则记录此稀释倍数为该组分的稀释值(TD值)。每个组分的TD值取自12个品评员品评结果的平均值。每个组分的TD值的误差不超过1个稀释水平。

1.4.5 呈味化合物结构鉴定

采用HRMS和NMR对通过TDA得到的关键呈味组分F4-7/5、F1-2和F1-3和进行分析，鉴定其中的呈味物质。具体分析结果如下:

2-羟基丙酸(3，图3-A2)。HRMS(ESI-)：测量值89.0232([M-H]-)，计算值C3H5O3，误差-1.4 ppm。MS/MS(m/z%)：89.0232(40)，43.0178(100)。

2-羟基-4-甲基戊酸(4，图3-A3)。HRMS(ESI-)：测量值131.0705([M-H]-)，计算值C6H11O3，误差1.7 ppm；MS/MS(m/z%)：131.0701(93)，113.0595(3)，86.0678(7)，85.0645(100)，69.0331(3)。

1.4.6 呈味化合物定量分析

采用标准曲线法进行定量分析。配制化合物1和2的标准品的工作液，每个化合物配制7个质量浓度的工作液，化合物1和2的浓度范围是10～1 000 μg/L。使用UPLC-MS/MS测量每个质量浓度工作液所对应的色谱峰面积，并制作相应的标准曲线。质谱采用阴离子模式下的多离子反应监测(MRM)进行测量。具体质谱参数为：离子源温度120 ℃，去溶剂温度450 ℃，毛细管电压0.6 kV，锥孔电压3 V，锥孔气流0.25 mL/min，去溶剂气流1 100 L/h。每个浓度测量6次，计算方法精密度。在测试回收率时，将确定含量的标准化合物加入酒样中，进行前处理后，测试浓度。具体计算方法：

取50 mL酒样，除去挥发性组分，将剩余难挥发组分装载至C18固相萃取柱，依次使用体积分数为20%和100%的甲醇水溶液洗脱，并收集100%甲醇洗脱下的组分。对该组分进行冻干处理。定量呈味物质1和2的浓度时，将各组分溶解于甲醇，稀释至标准曲线浓度范围内，经过0.45 μm膜过滤后，使用UPLC-MS/MS进行分析，每个样品测试3次。

使用BEH C18色谱柱对样品进行分离，流动相为1%甲酸水溶液(A)和甲醇(B)。洗脱梯度：流速0.3 mL/min，0 min A/B(70∶30)，1 min A/B(70∶30)，10 min A/B(0∶100)，11 min A/B(70∶30)，12 min A/B(70∶30)。

1.4.7 感官品评

感官品评方法参照HOFMANN等人文献[11]。挑选12个从事白酒品评2年以上的人员(6男、6女，年龄25～35)建立感官品评小组。为了分析难挥发酒样中的呈味物质，使用5种基本味觉(酸、甜、苦、咸、鲜)所对应的标准品溶液对品评人员进行再次培训。感官品评采用吞吐(sip-and-spit)的品评方式，安全起见，品评人员在品评样品后必须将样品吐出，不允许吞咽样品。在品评过程中，为了防止香气化合物的影响，品评人员必须佩带鼻夹。

味觉强度的测定：在品评酒样酱香1难挥发组分和其固相萃取分离组分的味觉强度时，将分离后的各组分溶解于2 mL 5%乙醇水溶液中，通过吞吐法品评样品并对其按照0(没有味觉)～5(能强烈感知)的强度级别进行打分。最终味觉强度取自12个品评员品评结果的平均值。

1.4.8 HRMS分析

使用HRMS对经过HPLC分离后的组分进行分析。将冻干后的呈味组分F4-7/5、F1-2和F1-3溶解2 mL甲醇中，浓度约为1 mg/L，经过0.45 μm膜过滤后直接进样分析。质谱使用阴离子全扫模式，扫描质量范围是10～800 u，分辨率为70 000 50%峰宽。数据使用Thermo Fisher Xcalibur软件进行分析。

1.4.9 NMR分析

使用NMR(400 MHz)对HPLC分离后的组分进行分析，温度为30 ℃。处理10 L酱香1，得到冻干后的组分F4-7/5约4 mg。根据溶解性，将样品溶解至500 μL CD3OD中并装入核磁管进行检测。检测得到数据使用MestReNova V6.1进行分析。

1.4.10 统计分析

使用Excel 2013软件对在6中酒样中检测得到的呈味化合物浓度进行单因素方差分析(p<0.01)。

2 结果与分析

2.1 酱香型酒样中难挥发组分的感官特征分析

在酱香、浓香和清香3大香型白酒中，酱香型白酒的难挥发组分最为复杂[3]。因此，本研究选用酱香型酒样进行分析。为了解析酱香型酒样中难挥发组分的感官特征，对50 mL酒样采用减压蒸馏和冷冻干燥技术除去挥发性组分，对剩余的难挥发组分进行感官品评。感官分析表明难挥发组分具有明显的苦味和酸味特征，其味觉强度分别为2.2和4.0(表1)。这2种味觉都是白酒重要的风味特征，微量苦味可以丰富白酒的风味[15]，适量酸味能够使白酒具有醇厚感[16]。为了解析难挥发组分中的苦味和酸味物质，以感官为导向，通过多级分离技术从难挥发组分中筛选出关键呈味组分，以进行后期结构鉴定。具体实验流程见图1。

图1 实验流程图Fig.1 Experiment scheme of this study

首先采用C18固相萃取柱按照化合物的极性对难挥发组分进行预分离，并对得到的组分进行感官品评。结果显示疏水性组分F4的苦味强度分别为2.0，亲水性组分F1的酸味强度为3.9；其他组分的味觉强度较弱或者无明显滋味(表1)。因此，将重点分析F4和F1这两个组分。

注：a难挥发组分由旋转蒸发仪分离制备，F1～F6为通过固相萃取分离后的组分；b得率通过称重获得，每个值测量3次取平均值；c苦味和酸味强度的品评值由12个品评人员评定，品评范围0(无明显味觉)～5(强烈感知)。

2.2 苦味组分F4的二级HPLC-TDA分析

采用UPLC-MS通过离子全扫模式对组分F4和F1进行初步检测，分析结果显示这2个组分非常复杂。为了分析组分F4和F1中的呈味化合物，对2 L酱香1酒样进行固相萃取分离并得到相应的组分F4和F1，使用HPLC对这2个组分进行进一步分离，结合TDA筛选出关键呈味组分。

首先使用C18色谱柱分离具有苦味特征的组分F4。感官品评分离后的组分得出，F4-7的TD值为8，其它组分的TD值均≤1(图2-A)。说明F4-7是难挥发组分中的主要苦味组分。但使用UPLC-MS分析后发现该组分仍含有多个离子，比较复杂，需要二级HPLC分离。

图2 苦味组分F4和的二级HPLC-TDA分析(A、B)以及F4-7/5的高分辨质谱分析(C)[9,10,13-三羟基-11(E)-十八烯酸(1)和9,12,13-三羟基-10(E)-十八烯酸(2)]Fig.2 Two-dimensional HPLC-TDA analysis of bitter-tasting fraction F4 (A,B) and HRMS analysis of fraction F4-7/5 (C)[9,10,13-trihydroxyoctadec-11(E)-enoic acid (1) and 9,12,13-trihydroxyoctadec-10(E)-enoic acid (2)]

使用苯基色谱柱对组分F4-7进行二级分离。在得到的组分中，仅有组分F4-7/5的TD值最高，其它组分虽有较强的色谱峰，但其TD均≤1(图2-A)。再次使用UPLC-MS分析后可知该组分所含主要离子是329 [M-H]-，可进行定性分析。

使用HRMS分析苦味组分F4-7/5，结果显示其所含离子的精确分子质量为329.2333 [M -H]-，对应元素组成是C18H34O5(不含阴离子)。分析该化合物的二级质谱信息，在子离子碎片中，有连续的H2O缺失(329、311、293，图2-C)，结合不饱和度(RDB=2)，可知该化合物可能含有羟基和羧基。通过Scifinder搜索具有这些结构信息的化合物并进行比对[17]，初步推测该组分中的化合物是一对互为同分异构体的三羟基十八烯酸。采用NMR技术进一步分析该化合物的结构特征。在13C谱中，可以明确解析出一个羧基碳(δ 176.4)，3个与羟基相连的碳(δ 71.7、74.3和75.4)和1对双键碳(δ 129.6 和136.3)。同样在1H谱中也可以分辨出这些基团所对应的氢。并且，在双键dd峰中的偶合常数为J=13.2，说明该双键是反式。最后，结合质谱信息确定羟基和双键的位置，并通过标准品的比对，鉴定出这一对同分异构体为9,10,13-三羟基-11(E)-十八烯酸(1)和9,12,13-三羟基-10(E)-十八烯酸(2，图2-A3)。文献报道这类三羟基脂肪酸是亚油酸的氧化产物[18]，具有典型的苦味特征，在多种食品中被检测到，对产品的风味具有重要影响[19-21]。亚油酸也是酿酒原料高粱中最主要的不饱和脂肪酸[22]，推测这类物质可能源于高粱中亚油酸的氧化分解。

2.3 酸味组分的HPLC-TDA分析

对酸味组分F1使用苯基柱分离，感官品评分离后的组分可知，F1-2和F1-3有明显的酸味，TD值分别是512和8，其他组分TD值均≤1(图3-A)。由此说明这2个组分是关键呈味组分，经过UPLC-MS分析可知组分F1-2和F1-3所含的主要离子分别是89和131 [M-H]-，可进行定性分析。

使用HRMS分析酸味组分F1-2和F1-3，结果显示它们所含主要离子的精确分子质量分别为89.023 2和131.070 5 [M-H]-，对应的元素组成分别为C3H6O3和C6H12O3(不含阴离子)。从分子式的不饱和度和含氧元素的个数分析，这2个化合物应该含有羟基和羧基。结合之前对白酒有机酸类化合物的分析[8]，推测这2种化合物分别为2-羟基丙酸(乳酸，3，图3-B)和2-羟基-4-甲基戊酸(4，图3-C)，再通过与标准品的比对，确定了它们的结构。虽然，在白酒难挥发组分中有多种有机酸[8]，但本研究通过TDA证明了化合物3和4是难挥发组分中最主要的两种呈味酸。

图3 酸味组分F1(A)的HPLC-TDA分析以及组分F1-2(B)和F1-3(C)的高分辨质谱分析[乳酸(3)和2-羟基-4-甲基戊酸(4)]Fig.3 HPLC-TDA analysis of sour-tasting fraction F1 (A) and HRMS analysis of fraction F1-2 (B) and F1-3 (C) [lactic acid (3) and 2-hydroxy-4-methylpentanoic acid (4)]

2.4 白酒中三羟基脂肪酸的含量分析

对在白酒中首次鉴定出的化合物1和2，采用UPLC-MS/MS技术通过MRM模式建立它们的定量方法。虽然化合物1和2互为同分异构体，但结构差异使它们具有不同的二级质谱信息(图2-C)。根据子离子碎片选择相应的定量离子，以实现对它们的分别定量分析。化合物1对应的定量离子为m/z329→201，标准曲线参数是y=12.87x-16.06(x：μg/L)，R2=0.998；化合物2对应的定量离子为m/z329→199，y=10.63x+15.33(x：μg/L)，R2=0.997。化合物1和2定量方法的精密度分别为5.4%和6.4%，回收率分别为93.7%和91.6%。精密度和准确性良好，可以进行定量分析。

为了分析化合物1和2的在白酒中的含量分布，选择其他酱香、浓香和清香型的酒样进行对比(表2)。结果显示，化合物1和2在酱香、浓香和清香共6种酒样中均存在，浓度范围分别为1.8～265.3和2.2～111.3 μg/L。但它们在6种酒样中的浓度具有显著性差异(p<0.01)，且在酱香型白酒中质量浓度最高，仅有化合物2在2种清香型酒样中的浓度无显著性差异。

表2 苦味化合物1和2a 在不同酒样中的含量b 单位：μg/L

注：a每个编号对应的化合物见图2；b同列不同的大写字母表示有显著性差异(p<0.01)。

3 结论

本研究采用TDA技术分析白酒难挥发组分中的呈味物质。通过以感官强度为导向，结合固相萃取和多级HPLC分离，从酱香型酒样的难挥发组分中筛选并分离出关键呈味化合物，对其进行结构解析。采用HRMS技术鉴定出了酸味化合物乳酸和2-羟基-4-甲基戊酸。采用HMRS结合NMR技术首次从白酒中鉴定出具有苦味特征的化合物9,10,13-三羟基-11(E)-十八烯酸和9,12,13-三羟基-10(E)-十八烯酸，并建立了其在白酒中的精确定量方法。文献报道三羟基十八烯酸是亚油酸的氧化产物，而亚油酸是酿酒原料高粱中最主要的不饱和脂肪酸，因此推测白酒中的三羟基十八烯酸可能源于高粱中亚油酸的氧化分解。此外，有关白酒中脂肪的代谢产物及其对风味的影响也值得关注和进一步研究。