PANDAR在分化型甲状腺癌中的表达及临床意义研究

高卫利 叶国超 刘力伟

CDKN1A反义链启动子DNA损伤激动RNA（promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA，PANDAR）是一种长度为1 506个核苷酸并定位于6p21.2的长链非编码RNA（LncRNA）[1]。越来越多的研究证据表明，PANDAR参与胃癌、肝细胞癌、膀胱癌等多种人类肿瘤的发生、发展，是肿瘤的重要基因调节因子和预后生物标志物之一。因此，本研究通过检测PANDAR在分化型甲状腺癌（DTC）中的表达水平，探讨PANDAR在DTC中表达的临床意义，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2010年1至12月在本院行手术切除治疗的97例DTC患者的DTC组织及其配对的癌旁正常组织（距癌组织＞2cm）。患者中男22例，女75例；年龄 18～79（42.0±12.4）岁。纳入标准：（1）患者颈部未曾受放射线照射治疗；（2）由常规病理学检查确诊DTC；（3）年龄18～80岁；（4）排除合并心、肝、肺、肾等脏器严重功能不全者；（5）合并其他恶性肿瘤者。患者术中切除的组织标本放入RNAlater保存试剂保存于-80℃液氮中冻存，于2013年初进行以下实验操作。

1.2 方法

1.2.1 DTC组织、癌旁正常组织PANDAR表达水平检测 采用qRT-PCR法。应用TRIzol试剂（美国Invitrogen公司），按说明书所述方法提取DTC组织、癌旁正常组织总RNA。使用RNA反转录试剂PrimeScriptTMRT reagent Kit（日本TaKaRa公司），按说明书所述方法进行反转录反应合成cDNA。按照qRT-PCR试剂盒SYBRPremix Ex TaqTM（日本TaKaRa公司）说明书的方法，以合成的cDNA为模板，加入反应试剂进行qRTPCR反应。PANDAR正义链为 5′-CTGTTAAGGTGGTGGCATTG-3′，反义链为 5′-GGAGGCTCATACTGGCTGAT-3′。GAPDH 正义链为 5′-CGCTCTCTGCTCCTCCTGTTC-3′，反义链为 5′-ATCCGTTGACTCCGACCTTCAC-3′。以GAPDH为内参进行标准化处理，采用△△Ct法计算PANDAR的相对表达水平。

1.2.2 DTC组织BRAFV600E突变情况检测 采用PCR法，具体方法详见本团队先前研究报道[2]。DTC组织进行DNA抽提后进行PCR扩增，设计引物：上游引物 5′-TCATAATGCTTGCTCTGATAGGA-3′；下游引物5′-GGCCAAAAATTTAATCAGTGGA-3′。然后琼脂糖凝胶电泳检测：PCR产物加入琼脂糖凝胶的点样孔中，观察样品弥散条带及凝像分析。最后进行DNA双向测序，以证实PCR结果的可靠性，并将测序结果与GenBank数据库进行比对以确定BRAFV600E有无突变。

1.3 观察指标 （1）观察并比较DTC组织、癌旁正常组织PANDAR表达水平；（2）以97例DTC患者的DTC组织PANDAR表达水平平均值为截点，将患者分为PANDAR高表达组（≥平均值）、低表达组（＜平均值），比较PANDAR高表达组与低表达组DTC患者临床病理特征与BRAFV600E突变情况。

1.4 统计学处理 应用SPSS 19.0统计软件；计量资料以表示，组间比较采用配对t检验；计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DTC组织、癌旁正常组织PANDAR表达水平比较DTC组织、癌旁正常组织PANDAR表达水平分别为3.684±0.089、1.273±0.078，DTC 组织 PANDAR 表达水平明显高于癌旁正常组织（P＜0.05）。

2.2 PANDAR高表达组与低表达组DTC患者临床病理特征比较 以DTC患者的DTC组织PANDAR表达的平均值3.684为截点，PANDAR高表达组患者56例，低表达组41例。两组患者性别、年龄、肿瘤直径、病理类型、肿瘤个数、有无侵犯包膜情况比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）；与PANDAR低表达组比较，PANDAR高表达组患者T分期较晚、淋巴结转移率较高、TNM分期较晚、肿瘤复发率较高（均P＜0.05），见表1。

表1 PANDAR高表达组与低表达组DTC患者临床病理特征比较[例（%）]

2.3 PANDAR高表达组与低表达组DTC患者BRAFV600E突变情况比较 PANDAR高表达组患者中BRAFV600E突变48例（85.7%），低表达组中BRAFV600E突变22例（53.7%）。PANDAR高表达组患者BRAFV600E突变率高于低表达组（P＜0.05）。

3 讨论

甲状腺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，国民发病率有逐年上升趋势[3]。DTC是分化良好的甲状腺癌病理类型，约占所有甲状腺癌的80%～90%。目前进展期DTC患者的数量及其发生肿瘤相关性病死率还在不断上升[4]。因此，寻找新型生物标志物以提高DTC的诊治水平、改善患者预后，具有重要的临床意义。

LncRNA是一类长度在200个核苷酸以上，不具有蛋白质编码功能的RNA，在肿瘤发生、发展中发挥着重要的作用。近来研究表明，LncRNA在参与基因转录调控、染色体重塑、转录后蛋白修饰、调控蛋白的功能和稳定性、癌细胞耐药性等方面起着重要的作用[5-12]。最初，Hung等[1]发现，PANDAR是一种长度为1 506个核苷酸并定位于6p21.2新型LncRNA。PANDAR在成纤维细胞DNA损伤反应中，被p53诱导激活，并通过与核转录因子NF-YA的相互作用，抑制促凋亡基因的表达，从而抑制细胞凋亡；DNA损伤和转录因子NF-YA与肿瘤发生、发展密切相关[13-14]。因此，PANDAR可能在肿瘤的发生、发展中发挥着重要作用。

研究发现，PANDAR参与多种人类肿瘤的发生、发展，而且在不同阶段扮演着双重角色。PANDAR在肝细胞癌[15]、膀胱癌[16]、胃癌[17]、结直肠癌[18]、宫颈癌[19]、肾癌[20]、胆管癌[21]中表达上调，且PANDAR的高表达与患者的临床病理特征与预后密切相关，可促进肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移。然而，在肺癌研究中，Han等[22]发现PANDAR在非小细胞肺癌组织中表达下调，且PANDAR低表达水平与肿瘤分期、肿瘤大小以及患者的不良预后密切相关。

在甲状腺癌研究中，Li等[23]采用qRT-PCR法检测DTC中PANDAR的表达，发现PANDAR在DTC中表达上调。本研究采用qRT-PCR法检测PANDAR在DTC组织及配对的癌旁正常组织中的表达水平。结果发现，PANDAR在DTC组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，并且与DTC的淋巴结转移、T分期及TNM分期密切相关。同时PANDAR的高表达与DTC患者肿瘤复发密切相关。这说明PANDAR在DTC中是一种促癌基因，在DTC的发生、发展中起着一定的作用。因此，PANDAR或可成为评估DTC患者预后的生物标志物之一。

在BRAF突变中，BRAFV600E突变（T1977A点突变）占90%以上。在DTC中，BRAFV600E突变是最常见的基因事件，文献报道BRAFV600E在DTC中的突变率有很大的差异，为29%～83%[24]。BRAFV600E突变与DTC中甲状腺包膜外浸润、淋巴结转移、临床病理分级等临床病理特征及患者预后密切相关[25]。本研究结果显示，PANDAR高表达组患者BRAFV600E突变率高于低表达组。

综上所述，本研究结果显示，PANDAR在DTC组织中表达上调，PANDAR高表达的DTC患者预后较差。PANDAR或可成为评估DTC患者预后的生物标志物之一。