IL-20及其受体在大鼠自身免疫性心肌炎不同阶段的表达

吴梁安 常贺 郭明 张宗辉 杨杰 王焱

IL-20是 IL-10家族（包括 IL-10、IL-19、IL-22、IL-24、IL-26、IL-28A、IL-28B 和 IL-29）的成员之一，IL-20有两个受体复合体：一个是IL-20R1/IL-20R2，另一个是IL-22R1/IL-20R2[1]。IL-20是重要的促炎性细胞因子，具有引起炎症、血管生成、趋化和凋亡的效应，在银屑病、动脉粥样硬化、中风、风湿性关节炎、急慢性肾衰竭的发病机制中起了重要作用[2-5]。自身免疫性心肌炎（EAM）是由于机体细胞免疫和体液免疫功能异常，产生致敏性T淋巴细胞和多种自身抗体，这些自身抗体与抗原反应形成免疫复合物，通过血液循环进入心肌纤维，引起心肌细胞水肿、溶解、坏死及单核细胞浸润等一系列炎症反应。大鼠EAM类似于人类的巨细胞性心肌炎，已经被证实是T细胞介导的EAM[6]，目前认为Th1和Th2细胞因子的平衡对于控制EAM的疾病过程和修复很重要。然而IL-20及其相关受体在EAM发病过程中的表达特征尚未见报道，其在EAM发病机制中所起的作用还有待进一步阐明。本研究采用大鼠EAM模型，通过检测IL-20及其受体链在心肌炎急慢性期各阶段的表达，进一步探讨IL-20及其受体在心肌炎发病机制中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物 8周龄Lewis雄性大鼠20只，体重180～220g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司[许可证号SCXK（京）2002-003]，饲养于厦门大学医学院实验动物中心。

1.2 主要试剂及仪器 含H37Ra株热灭活结核杆菌的弗氏佐剂（美国Difco公司）；Trizol（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒RevertAid First Strand cDNA kit（美国 Fermentas公司）；RT-PCR酶 DreamTaq Green PCR master mix（美国 Fermentas公司）；SYBR Premix Ex Taq（大连宝生物工程有限公司）；引物设计合成（表1，大连宝生物工程有限公司）；一次抗体：Goat polyclonal antibody to IL-20（美国 Santa Cruz公司），Rabbit polyclonaly antibody to GAPDH（美国ABcam公司），二次抗体：Penxiclase-Labeled Affinity Purified rabbit antibody to Goat IgG（美国 KPL公司），Peroxidase-conjugated Affinipure Goat anti-Rabbit IgG（美国ABcam公司），RatIL-20ELISA试剂盒（美国R&D公司）。C1000双模块梯度PCR仪（美国BIO-RAD公司），7500型实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司），蛋白凝胶电泳系统（美国BIO-RAD公司），iMARK酶标仪（美国BIO-RAD公司）等。

表1 IL-20及其各受体的引物序列

1.3 抗原制备 提取猪心室肌球蛋白溶解于0.3 mol/L KCl溶液中配制成浓度为10mg/ml，加同等体积含结核杆菌H37Ra株的完全弗氏佐剂，充分混合制成抗原。

1.4 动物分组与EAM模型制作 将20只大鼠按数字表随机分为4组，即：（1）对照组：即未制作EAM模型组；（2）EAM 3 周组；（3）EAM 6 周组；（4）EAM12 周组，每组5只。3组EAM大鼠双后足各皮下注射以上制备的抗原0.1ml完成建模，对照组注射等量0.9%氯化钠注射液。

1.5 组织病理学检查 3组EAM大鼠建模当天作为0d，观察至建模后3、6、12周后处死，对照组12周后处死。取出心脏称重并计算心脏重量/体重比值，取心尖部约5mm厚度心肌，10%甲醛溶液固定，石蜡包埋、切片，HE法染色，光镜下观察。

1.6 实时荧光定量RT-PCR检测IL-20及其相关因子的mRNA表达 取各组大鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏组织，Trizol法提取各组织RNA，逆转录试剂盒合成cDNA（2μg/20μl），采用实时荧光定量 RT-PCR 进行扩增反应，检测 IL-20及其受体链（IL-20R1/R2，IL-22R1）在各脏器组织中的mRNA表达，以及在各阶段心肌组织中的mRNA表达。

1.7 Western blotting检测EAM大鼠心肌组织IL-20的蛋白表达 取各组EAM大鼠心肌组织约100mg剪碎，放入1ml RIPA组织裂解液（含1mmol/L PMSF）中机械匀浆，超声细胞破碎仪破碎细胞，冰上孵育30min，4℃低温10 000r/min离心10min取上清液。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测总蛋白质浓度，加入5×蛋白上样缓冲液，100℃5min裂解蛋白，制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶（12%分离胶和 15%的浓缩胶），每孔加蛋白样品 20～180μg，电泳（积层胶：电泳70V，20min分离胶：电压100V，75min），湿法转膜（90V 恒压下 30min），5%脱脂奶粉PBS缓冲液室温封闭1～2h或4℃过夜，一次抗体：Goat polyclonal antibody to IL-20（1∶200），Rabbit polyclonaly antibody to GAPDH（1∶2 000）稀释,1～2h 或 4℃过夜，TBST洗膜5次，二次抗体：Penxiclase-Labeled rabbit antibody to Goat IgG（1∶10 000），Peroxidase-conjugated Goat anti-Rabbit IgG（1∶5 000），稀释室温孵育1h，TBST洗涤5次，加Super Signal发光试剂,暗室显影30s～30min不等并冲洗胶片，扫描胶片。

1.8 ELISA检测各组EAM大鼠心肌组织匀浆IL-20蛋白含量（IL-20蛋白/总蛋白） 取各组EAM大鼠心肌组织约100mg剪碎，放入1mlRIPA组织裂解液（含1mmol/L PMSF）中机械匀浆,超声细胞破碎仪破碎细胞，冰上孵育30min，4℃低温 16 000r/min离心15min取上清液。采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测总蛋白质浓度。并应用ELISA试剂盒检测IL-20的蛋白浓度（标准品蛋白标准曲线相关系数＞0.99）。

1.9 统计学处理 采用Graph pad prism 5.0统计软件进行分析并作图，数值以表示，多组间比较采用一元线性回归Anova检验，两组间比较采用非配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心脏外观、心肌组织病理学改变和心脏/体重比值的比较 见图1。

由图1可见，EAM大鼠免疫3周时心肌组织可见广泛多量炎性细胞浸润和组织坏死，并可见少量的心肌纤维化；6周时炎症细胞明显减少，可见大量的心肌纤维；12周时炎症细胞几乎消失，心肌纤维化仍十分明显。与对照组比较，EAM大鼠免疫后心脏重量/体重比值（mg/g）3周时明显升高（P＜0.01），6周和 12周无明显差异。

2.2 IL-20在EAM大鼠3、6周时各脏器中的mRNA表达 见图2。

图1 各组大鼠心脏外观（a）、心肌组织病理学改变（b，HE染色，×20）和心脏/体重（c，mg/g）比值的比较（与对照组比较，**P＜0.01）

图2 IL-20及其受体链在EAM 3周和6周时各组织的mRNA表达

由图2可见，实时荧光定量RT-PCR结果显示，在EAM急性期（3周时）IL-20与IL-20R2主要在心脏表达，IL-20R1主要在肾脏表达，IL-22R1主要在脾脏表达；在EAM慢性期（6周时）IL-20在心、肝、脾、肾均有明显表达，IL-20R1主要在肾脏表达，IL-20R2、IL-22R1主要在心脏表达。

2.3 心肌组织中IL-20及其受体链（IL-20R1/R2，IL-22R1）在EAM大鼠急慢性期各阶段的mRNA表达 见图3。

由图3可见，实时荧光定量RT-PCR的结果，IL-20R1/IL-20R2两条受体链在EAM大鼠心肌组织的表达高峰均出现在急性期（3周时）（均P＜0.05），随后逐渐减少，在慢性期（6、12周时）已基本接近正常水平，而IL-20及另一受体链IL-22R1在EAM大鼠心肌组织的表达3周时逐渐升高，6周时达高峰（均P＜0.05），12周时又逐渐下降，但仍处于较高水平。

图3 IL-20及其受体链在EAM大鼠心肌组织各阶段的mRNA表达（与对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 IL-20在EAM大鼠心肌组织的蛋白水平及含量见图4。

图4 IL-20在EAM大鼠心肌组织蛋白匀浆中的含量（a）以及心肌组织的蛋白水平（b）（与对照组比较，*P＜0.05）

由图4可见，Western blotting结果显示，心肌组织中IL-20的蛋白表达在EAM3周时表达开始升高，6周时达到峰值，12周时逐渐下降。心肌组织蛋白匀浆中IL-20含量即IL-20蛋白/总蛋白（pg/ng）的结果与Western blotting结果表现为相同的趋势性。

3 讨论

本研究通过检测IL-20及其受体在大鼠EAM各脏器及心脏组织各阶段的表达特征，阐述了IL-20参与EAM的发病进程并发挥了重要的作用。我们的结果显示在EAM大鼠急性期（3周时）IL-20主要在心脏表达，在6周时心、肝、脾、肾均有明显表达；IL-20心肌组织中的表达在大鼠EAM急性期3周时逐渐升高，并且在EAM 6周时达到高峰，随病程的进一步进展IL-20在慢性期（12周）的表达水平逐渐降低，提示IL-20可能参与了EAM急性期的炎症启动，并在慢性期的炎症反应或纤维修复过程中扮演重要作用。

另外，IL-20通过IL-20R1/R2、IL-22R1三条单链形成的两个受体复合物（IL-20R1/R2、IL-22R1/IL-20R2）发挥作用，本研究结果也显示IL-20R1/R2、IL-22R1在EAM大鼠急性期（3周时）及在慢性期（6周时）的心脏组织均有较高的表达。而IL-20R1/IL-20R2表达的高峰在急性期（3周时），IL-22R1/IL-20R2表达的高峰期出现在慢性期（6周时），笔者进一步推测IL-20在急性期通过受体复合物IL-20R1/IL-20R2介导起生物学效应，而在慢性期通过IL-22R1/IL-20R2起作用，这一结果证明在EAM急慢性期时心脏组织均存在IL-20作用的靶细胞，进一步表明IL-20参与了EAM的发生及发展过程，而且可能主要在慢性炎症或纤维修复过程中扮演重要作用。之前的研究显示EAM是T细胞介导的EAM，Th1细胞因子启动了炎症反应；并且在EAM的心脏组织发现有各种细胞因子的分泌。IL-20是近年来被发现和关注的一个新型的多效性的细胞因子，目前关于IL-20免疫炎症方面的生物学作用还知之甚少。先前的研究报道IL-20可能与一些免疫性疾病有关。在银屑病患者受损的皮肤与未受损的皮肤及正常皮肤比较IL-20的表达是升高的，而且IL-20R2、IL-20R1和IL-22R1也存在明显的高表达[7-9]。此外，在HaCaT细胞IL-20通过STAT3刺激信号转导，上调角质细胞生长因子的转录[10]。在银屑病患者中，IL-20可能在局部促发CD8＋T细胞和通过产生角质细胞生长因子间接的促进增值反应以维持角质细胞的过度增殖状态，也可能通过激活CD8＋T细胞产生TNF-a并引发新的炎症级联反应。应用规范的银屑病药物治疗后IL-20mRNA的表达下降。当银屑病患者以抗CD2和抗TNF－a抗体的药物治疗后同样可以发现IL-20表达的下降。最近的研究发现不但IL-20，还有它的3个受体链都在滑液膜和起源于RA患者和CIA大鼠（一个模拟人RA的模型）的滑液组织的滑液成纤维细胞中表达[11]。RA患者与正常人相比滑液膜IL-20和IL-20的3条受体链的基因和蛋白表达都是升高的。巨噬细胞和滑液成纤维细胞产生IL-20，IL-20又通过激活ERK1/2和 JNK 信号分子诱导 TNF-a、IL-1b、MMP-1、MMP-13的表达；并且IL-20还能诱导化学趋化因子如MCP-1和IL-8，随后再招募中性粒细胞和T-细胞加重炎症。此外，将抗IL-20单克隆抗体（7E）或可溶性IL-20R1质粒DNA来治疗胶原诱导的关节炎大鼠模型，关节炎的严重程度明显减轻[5]。有研究显示在动脉粥样硬化患者的动脉壁存在高表达的IL-20及其受体[12]。在硬化的动脉内皮细胞中能检测到IL-20R1和IL-20R2。内皮细胞表达IL-20R1和 IL-20R2[13]，所以可能会成为IL-20的靶细胞。IL-20诱导人的脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，在人脐静脉内皮细胞IL-20也诱导血管形成因子bFGF和VEGF，及基质金属蛋白酶2的表达，而VEGF在动脉粥样硬化的发展中扮演了重要的作用，并且升高血胆固醇浓度[14]。

总之，IL-20及其受体参与了EAM的发病与发展进程，而且在EAM的急慢性期炎症反应过程中通过不同的受体链IL-20R1/IL-20R2和IL-22R1/IL-20R2介导生物学效应。尽管仍有许多关于IL-20的生理作用和确切的分子机制有待解释，但先前的研究给了我们新的观点和启示，在IL-20相关的疾病中通过阻断IL-20及其受体复合物的活性包括IL-20的抗体，小分子失效剂如阻断IL-20细胞表面的受体或抑制IL-20细胞内的信号分子，可能会成为药物新的治疗靶向。这也为深入探讨EAM或自身免疫性疾病发病机制提供一个新的实验依据，关于IL-20在免疫炎症中的深入研究我们将继续探索。