离子色谱法测定水果中的有机酸

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(杭州市余杭区食品药品监测中心，浙江 杭州 311100)

水果富含水分、糖分、纤维素、维生素和有机酸等，是公认的健康食品.其中的各种有机酸不仅对水果的风味和营养有着重要影响，而且部分有机酸还有着特殊的功效，如抗氧化、防腐和抑菌等[1].有机酸是三羧酸循环中的一个重要生化特征，水果采摘后，其新陈代谢过程依然在继续，并且不断变化，因此，有机酸也是水果质量的动态判断指标[2].检测有机酸的方法有很多，但各有局限.例如滴定法只适合测定总酸[3]；酶学法适合测定某种特定有机酸[4]；光谱法通常要进行预衍生化、预分离等前处理，过程麻烦且能同时分离的有机酸种类少[5]；由于有机酸沸点高，不易汽化，因此气相色谱法准确度欠佳等[6].

高效液相色谱中的离子交换色谱法对有机酸的测定比较有优势，准确、快速、灵敏并能同时分离和测定多种离子[7].宋卫得等利用梯度淋洗离子色谱法测定了白酒中26种有机酸和阴离子[8]，吕洪风利用离子色谱保留模型同时检验果汁中7种有机酸，对3种不同的苹果汁进行分析,验证了该方法的精准性和适用性[9]，研究选择西瓜、菠萝和枇杷3种水果，应用离子交换色谱法测定水果中的有机酸的变化规律，为水果质量的鉴别提供依据.

1 实验仪器材料和方法

1.1 原材料

西瓜、菠萝、枇杷，购于杭州勾庄水果市场.

1.2 有机酸标准样品(均为优级纯)

乳酸[L(+)Lactic acid]，SUPELCO，99%；草酸[Oxalic acid (Ethanedioic acid) ]，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；苹果酸(DL-Malic acid)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；柠檬酸(Citric acid monohydrate)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%；酒石酸(DL-Tartaric acid)，Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%.

1.3 实验仪器

ICS3000离子色谱仪，美国戴安公司；Y型精密电子天平，美国双杰兄弟有限公司；PHILIPS打浆机，广州市奇明经济发展有限公司；TGL-16M高速立式冷冻离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；HYJD超纯水器，杭州永洁达净化科技有限公司；水相针式滤器(聚醚砜)，0.22 μm，上海安谱科学仪器有限公司；一次性使用1 mL注射器(带针)，上海康寿医疗器械有限公司；1 000，200 μL移液枪，上海艾测电子科技有限公司.

1.4 试验方法

1.4.1 实验材料的选择

选择成熟度相仿、大小相近、颗粒完整的枇杷，常温条件阴凉处保存，每隔12 h取样一次，每次取样以5个为一组，从外观上挑选成熟度接近的原料，每次取样时都去除果皮，尽可能选择果实的相同部位.

选择体积较大的西瓜、菠萝各一个，选取一圆周，取样部位都在靠近果皮的一侧，每隔一天取样一次，取样后取样部位用保鲜膜包裹，在常温下保存，取样和保存都在超净台上完成.

1.4.2 样品前处理

每隔1 d，分别准确称取10 g左右西瓜、菠萝、枇杷果肉.加90 mL去离子水，研磨，之后在4 ℃，13 000 r/min条件下，离心20 min，取上清液即为提取液.用移液枪移取提取液300 μL、去离子水1 200 μL于试剂瓶中，得到稀释50倍的样品溶液，再用0.22 μm的滤膜过滤后供离子色谱进样测试.

1.4.3 标准液的配制

用电子天平分别称取柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸、乳酸0.050 g，定容至50 mL容量瓶中，配制成1 000 mg/L的标准储备液.分别用移液枪准确移取柠檬酸液500 μL、苹果酸液500 μL、酒石酸液500 μL、乳酸液500 μL和草酸液500 μL，并入100 mL容量瓶中，然后用超纯水定容至刻度，从而得到柠檬酸质量浓度为5 mg/L、苹果酸质量浓度为5 mg/L、酒石酸质量浓度为5 mg/L、乳酸质量浓度为5 mg/L和草酸质量浓度为5 mg/L的混合标准液.

1.4.4 色谱条件

抑制器膜：ASRS_4 mm；色谱柱：IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm；保护柱：IonPac AS11-HC 4 mm×50 mm；流动相：KOH (淋洗液自动发生器产生)，进行梯度测试，流速为1.0 mL/min；抑制电流为150 mA；柱温30 ℃；进样量为50 μL.

2 结果与分析

2.1 色谱柱的选择

对比IonPac AS11 4 mm×250 mm和IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm两种色谱柱的分离效果，可以发现两者的离子交换功能基均为带季铵盐功能基的阴离子交换树脂，对OH-的选择性强，亲水性较强.但是，IonPac AS11 4 mm×250 mm的柱容量很小，仅有45 μmol/柱；而IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm柱的柱容量较高，达到了270 μmol/柱，柱容量越大越有利于对乳酸、乙酸等一价有机酸的保留，色谱出峰时峰形越好，更有利于实现样品中多组分的同时分离.另外一方面，通过实验对比对弱组分的保留情况看，IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm柱对目标化合物的分离效果好于IonPac AS11 4 mm×250 mm.所以本实验选用IonPacAS11-HC 4 mm×250 mm色谱柱.

2.2 流动相与梯度的优化

离子交换色谱法分析有机酸常用稀碱溶液作淋洗液.因OH-为亲水性离子，对固定相中的水合区有着天然的亲水性，从而能够有效地置换其他阴离子.常用氢氧化钠或氢氧化钾作淋洗液，因为K+的当量电导较低，所以本实验采用KOH作淋洗液.由淋洗液自动发生器产生，保证了其高纯度，避免杂质的污染，浓度准确，流速稳定，平衡时间短，降低基线漂移，出峰平直、稳定.

实验采用梯度洗脱技术，在分离过程中连续改变流动相中的KOH浓度.分别采用0.6,0.8,1.2,1.6,2.0,10,20,30 mmol/L KOH淋洗液淋洗，发现淋洗液浓度为30 mmol/L时，柠檬酸较易洗脱，淋洗液浓度为0.8 mmol/L时，乳酸、草酸、酒石酸、苹果酸能较易洗脱，得到尖锐峰形.经过多次试验确定淋洗液KOH浓度梯度程序如表2所示.

在该淋洗条件下，5种有机酸可实现基线分离，分离效果如图1所示.

表1 离子色谱梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program of ion chromatography

图1 5种有机酸混合标准溶液色谱图Fig.1 The chromatogram of 5 kinds of mixed organic acid standard solution

分别调节流速为0.6,0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL/min，当流速增大时，分析时间明显缩短，但当流速大于1.0 mL/min时，5种有机酸有机酸会与其中其他的杂质峰所重叠，不利于出峰的形状，当流速小于1.0 mL/min时，5种有机酸的出峰时间延长，但对5种有机酸的分离度影响并不大.因此，本实验选用1.0 mL/min的淋洗液流速.

2.3 方法的线性范围及检出限

根据混合标准液出峰值的大小，分别取5种有机酸储备液100 μL，稀释定容于100 mL容量瓶中，配制成混合标准液.以质量浓度(mg/L)为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，进行线性回归.同时，按3倍信噪比计算得出检出限，5种有机酸的线性方程列于表2.对菠萝进行加标回收实验，取两份样品，一份加标，一份对照，重复测定6次，进行回收率实验.

由表2可知：该方法所得出的指标中，选择的离子色谱检测体系对有机酸的检测显示了较高的灵敏度，检出限较低，精密度好，被测组分的峰面积与进样质量浓度呈良好的线性关系，且线性范围宽，满足所测3种水果中有机酸含量的变化特征的检测要求.5种有机酸的加标回收率为95%～100%，相对标准偏差RSD(n=6)均小于3.0%，该方法具有较好的稳定性和回收率.

表2 5种有机酸的线性范围、检出限和回收率Table 2 Linear range,detection limit and recovery rate of 5 kinds of organic acids

2.4 样品中的有机酸

按照实验优化的色谱条件，将处理好的样品在梯度淋洗离子色谱中得到以下色谱图，菠萝样品见图2.

图2 菠萝样品中有机酸的离子色谱图Fig.2 Ionic chromatograms of organic acids in pineapple

图中常见的5种有机酸分离效果良好，图2为菠萝样品的有机酸色谱图.图谱中共有10个峰，可以定性得出，菠萝中的有机酸含有苹果酸、柠檬酸、草酸、乳酸和酒石酸，图谱中还有5个峰没有定性，除了第2个未知峰之外，其他峰含量很小，分析可以得出菠萝中主要有机酸为柠檬酸和苹果酸，分别占总酸的67%，26%左右.

由色谱图的峰面积自动计算得到菠萝里5种有机酸含量，见表3.

表3 菠萝样品中有机酸的质量分数Table 3 The content of organic acids in pineapple

图3为枇杷样品中有机酸的离子色谱图.

图3 枇杷样品中有机酸的离子色谱图Fig.3 Ionic chromatograms of organic acids in loquat

图谱中共有9个峰，可以定性得出，枇杷中的有机酸含有乳酸、草酸、柠檬酸、酒石酸和苹果酸，其中最主要的是苹果酸，其含量远远高于其他有机酸，占总酸的94%左右，其次为酒石酸和草酸.

由色谱图的峰面积自动计算得到枇杷里5种有机酸含量，见表4.

表4 枇杷样品中有机酸的质量分数Table 4 The content of organic acids in loquat

图4为西瓜样品中有机酸的离子色谱图.

图谱中共有8个峰，可以定性得出，西瓜果实中含有的有机酸为乳酸、草酸、柠檬酸、酒石酸和苹果酸，其中最主要的是苹果酸，其含量约占总酸的78.7%，其次是柠檬酸和酒石酸.

由色谱图的峰面积自动计算得到枇杷里5种有机酸含量，见表5.

图4 西瓜样品中有机酸的离子色谱图Fig.4 Ionic chromatograms of organic acids in watermelon

表5 西瓜样品中有机酸的质量分数Table 5 The content of organic acids in watermelon

2.5 水果贮藏过程中有机酸的代谢

有机酸是水果的一个标志性特征成分，因采摘后的水果依然有新陈代谢，所以在水果储藏期间有机酸含量是动态变化的.而且不同水果变化状况有所区别的，以下是储存5 d的水果有机酸变化情况.

2.5.1 菠 萝

在保证其他条件一致的前提下，将每天一次采集到的样品进行离子色谱测定，得到相应时间段的结果见表6.

表6 菠萝果实贮藏期间有机酸质量分数的变化情况Table 6 Thecontentoforganic acids in pineapple during storage

由表6可以可知：从含量上看柠檬酸和苹果酸是菠萝储存代谢中的主要有机酸，其次为草酸和乳酸，酒石酸的含量最少.在5 d的储藏期内，柠檬酸、苹果酸和总酸都是呈现上升的趋势，尤其是第5天相比第1天，总酸量高出近一倍，所以菠萝储存时间越长酸涩味越强甜度越低也就显而易见了.草酸、乳酸和酒石酸在5 d的时间内，相对来说变化不是很大，对菠萝口感影响较小.虽然也有其他相关资料报道菠萝在贮藏过程中柠檬酸和总酸的含量都呈现先上升后下降的趋势，但是与本实验并不矛盾，因本实验储存时间短，只有5 d.之所以这样考虑，是因为作为水果食品，新鲜度十分重要，如果储存过长时间，就会导致水果的腐烂变味甚至无法食用.

2.5.2 枇 杷

与菠萝相比枇杷更易腐烂，所以在48 h之内完成5次采样，离子色谱测定结果见表7.

表7 枇杷果实贮藏期间有机酸质量分数的变化Table 7 The content of organic acids in loquat during storage

由表7可以看出：枇杷中苹果酸最多，占总酸94%左右，柠檬酸、草酸、乳酸和酒石酸含量较少.在前36 h苹果酸和总酸含量呈上升趋势，48 h的数据显示柠檬酸、苹果酸和总酸含量都在下降，草酸、乳酸和酒石酸略微上升的.这也解释了为什么枇杷采摘后随着储存时间的延长越来越淡而无味.另外随着枇杷果实的衰老与腐烂的开始，酸的下降速度加剧，所以如果常温保存，一般在36 h内最好食用完，否则品质会急剧下降.

2.5.3 西 瓜

可能因为西瓜中有机酸含量少，测定难度稍大，关于西瓜中有机酸含量的测定鲜有报道，未见用离子色谱法测定西瓜中的有机酸，本实验对此作了探索.西瓜采样方法与菠萝相同，表8是离子色谱法测定的结果.

表8 西瓜果实贮藏期间有机酸质量分数的变化Table 8 The content of organic acids in watermelon during storage

由表8可以看出：西瓜中苹果酸和柠檬酸最多，分别占总酸的73%左右和20%左右，而草酸、乳酸和酒石酸较少.在前3天苹果酸、柠檬酸和总酸含量呈现上升趋势，第4天数据显示柠檬酸和总酸在下降，苹果酸和乳酸却有上升.可能西瓜在前3天单纯处于果实后熟阶段，之后品质开始下降，并伴随着柠檬酸的大量消耗.可见，新鲜西瓜在常温下放置的时间也不宜过长，一般放置2 d左右西瓜风味较好.

3 结 论

实验建立了离子交换色谱法测定菠萝、枇杷、西瓜中5种有机酸含量的方法.3种水果中含有多种有机酸，但经过实验中样品处理、色谱柱的选择、梯度淋洗等方法，使得常见有机酸的极性和离解的难易程度与所测定的5种有机酸差异很大，所以对5种有机酸的测定基本没有影响.实验证明，选用IonPac AS11-HC 4 mm×250 mm色谱柱，分别在0.8，30 mmol/L KOH淋洗液条件下以1.0 mL/min的流速进行离子色谱法测定5种有机酸的方法，样品前处理简单，操作方法简便、快捷，线性范围宽，分析结果可靠，应用范围广.3种果实采摘后，其中的有机酸的积累仍然没有停止，在贮藏过程中，枇杷和西瓜果实中的有机酸含量都是先增加后降低，主要是柠檬酸的代谢而消耗，菠萝果实中的有机酸含量一直在递增，说明菠萝果实的取样时间太短，菠萝果实还处于后熟的过程，有机酸的代谢速度慢.3种水果果实中的有机酸含量分别为菠萝>枇杷>西瓜，说明菠萝的风味主要由有机酸组成，而西瓜的风味则主要由果实中的糖类构成，3种果实的贮存时间长短分别为菠萝>西瓜>枇杷.