桑椹成熟过程中1-脱氧野尻霉素和花青素含量变化规律

黄金枝 邓真华 俞燕芳 胡桂萍彭晓虹 杜贤明 曹红妹 胡丽春

( 1.江西省蚕桑茶叶研究所330202; 2.江西省蚕桑工程技术研发中心)

桑椹系桑科植物桑的成熟果实，又名桑果、桑实和桑枣。桑椹属浆果类型，营养丰富，含有丰富的花色苷、白藜芦醇等黄酮类活性成分以及多糖、氨基酸、碳水化合物、有机酸、维生素、矿物质等多种基础营养成分[1]，是制作现代食品和保健产品的优质天然原料[2～3]。

桑椹收获时间比较集中，果皮薄，汁液多，组织娇嫩，在收获和运输的过程中很容易软化、腐烂，并且严重影响它的营养和经济价值。通过了解桑椹发育成熟期间的营养活性成分含量变化规律，能够为桑椹适时采摘和实施相应的保鲜技术措施提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料及主要试剂和仪器

试验对象为无籽果桑大十，采自江西省蚕桑茶叶研究所果桑园。对桑椹果实的发育期进行划分，依次为全绿期、半粉红期、粉红期、全红期和紫黑期[4]。同一发育期采摘桑椹2 kg，并迅速带回实验室，存放在-80℃冰箱中备用。测定时将其研磨混匀，准确称取一定重量，重复取3次，用于成熟过程中DNJ和花青素含量测定。

生物碱标准品为1-脱氧野尻霉素，花青素标准品为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-芸香糖苷。盐酸、硼酸钾、FMOC-Cl、乙腈、甘氨酸、醋酸、乙醇、偏磷酸、磷酸为色谱纯。

设备：Agilent 1260高效液相色谱(美国安捷伦科技公司)。

1.2 桑椹生物碱的测定[5]

1.2.1 样品制备

取新鲜桑椹10g，研磨均匀，得到桑椹浆，取10g桑椹浆于50mL离心管中，加入0.05mol/L盐酸溶液10mL，涡旋提取3min，离心15min(转速12 000r/min)，取上清液，同法重复提取一次，离心，合并2次提取液并转移至50mL容量瓶，蒸馏水定容即得。

1.2.2 标准溶液配制及工作曲线建立

准确称取20mgDNJ标准品于25mL容量瓶中，加超纯水溶解并定容，即得0.8g/L的DNJ标准溶液，稀释至质量浓度为60μg/mL、120μg/mL、180μg/mL、240μg/mL、300μg/mL、480μg/mL备用。以DNJ的质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标绘制标准曲线，得DNJ的标准曲线线性回归方程。

1.2.3 衍生化反应[5]

取DNJ提取液(或DNJ标准液)100μL，再加入5mmol/L的FMOC-Cl(溶解于乙腈中)200μL，混匀后于25℃水浴20min。加入1mol/L甘氨酸100μL中和剩余的FMOC-Cl以终止反应，加入1%醋酸100μL及超纯水400μL，以0.45μm微孔滤膜过滤器过滤，收集滤液备测。空白对照以蒸馏水代替DNJ提取液进行衍生化反应。

1.2.4 HPLC检测条件[5]

色谱柱C18柱(150mm×4.6mm×5μm)；荧光检测器激发波长254nm，发射波长322nm；流动相为乙腈-0.1%醋酸(体积比50:50)；流速1.0mL/min；柱温25℃；进样量10μL。

1.3 桑椹花青素的测定[6]

1.3.1 样品制备

取新鲜桑椹10g，研磨均匀，得到桑椹浆，取5g桑椹浆加入20mL酸性乙醇(含1%HCl)，超声波提取30min，12 000r/min离心10min，取上清液作检测样品。

1.3.2 标准溶液配制及工作曲线建立

准确称取C3G标准品1mg和C3R标准品1mg，分别加入1mL和500μL混合液(无水乙醇：偏磷酸：超纯水=3:1:6)作为储备液，4℃保存备用。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立花青素标准曲线。

1.3.3 HPLC检测条件[6]

谱柱：ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。流动相A为乙腈，B为0.4%磷酸。流动相A洗脱程序为：0～10min，9%～15%乙腈；10～20min，15%～35%乙腈；20～24min，35%～9%乙腈。流动相B洗脱程序为：0～10min，91%～85%磷酸；10～20min，85%～65%磷酸；20～24min，65%～91%磷酸。流速1.0mL/min，检测波长520nm，柱温30℃，进样量20μL。

1.4 数据分析

采用Excel对测定数据进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 桑椹成熟过程中DNJ含量变化

采用HPLC法对桑椹成熟期间的DNJ含量进行检测，以标准品的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得到DNJ含量检测的标准工作曲线y=6.667x+35.26(R2=0.999)，通过峰面积与标准曲线计算出桑椹成熟过程中DNJ的含量，所得结果见图1。如图1所示，桑椹从全绿期到紫黑期，桑椹中的 DNJ含量逐渐下降，至紫黑期含量为零。即全绿期 DNJ 含量较高，而随着桑椹的不断成熟，DNJ 含量逐渐减少，说明 DNJ主要存在于其幼嫩和重要的组织器官之中，如嫩叶、幼果等。全绿期桑椹中DNJ含量较高，但果品质较差，多糖和黄酮含量较少，不适合桑椹深加工，DNJ含量也远低于桑叶，也不合适作为生产 DNJ 产品的原料开发[7]。

图1 桑椹成熟过程中DNJ 含量变化

2.2 桑椹成熟过程中花青素含量变化

采用HPLC法对桑椹成熟过程中的花青素含量进行检测，以标准品的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，得到C3G含量检测的标准工作曲线y=3639x-4.381(R2=0.999)，C3R含量检测的标准工作曲线y=6756.5x+49.243(R2=0.997)。通过峰面积与标准曲线计算桑椹成熟期间C3G和C3R的含量，结果如图2所示。桑椹在成熟过程中C3G和C3R含量都呈现逐渐增加的趋势，在桑椹半粉红期前均缓慢增加，粉红期后2种花青素的含量急剧上升；2种花青素的含量差异很大，C3R含量高于C3G含量。桑椹在成熟过程中，外观颜色会由绿色变为粉红色，再到紫红色，最后变为紫黑色，这种外观颜色的变化，主要有两方面的原因：①在成熟过程中叶绿素逐渐降解，花青素含量逐渐积累；②随着pH值上升，花色苷的色调发生了改变。

图2 桑椹成熟过程中花青素含量的变化

3 讨论

生物碱DNJ作为一种高效的α-糖苷酶抑制剂，是桑树体内次生代谢产生的一种重要防御物质[8～9]。从本实验的检测结果可以看出，桑椹在全绿期的DNJ含量很高，而随着桑椹逐渐成熟，DNJ含量逐渐减少。本实验检测在桑椹全绿期花青素的含量几乎为0，随后逐渐缓慢增加，到粉红期开始大量合成花青素，其含量迅速增加，紫黑期桑椹中花青素C3G和C3R的含量均达到最大值，这与在葡萄、荔枝等果实中的研究结果一致[10～11]。在桑椹成熟期间，DNJ含量逐渐减少，而C3G和C3R的含量逐渐增多，因此，生产上需根据加工桑椹食品的保健功效采收不同成熟期的桑椹做原料。