液相色谱串联质谱法测定血清中腺苷含量

程 浩

(安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥 230051)

腺苷(Adenosine,AD) 是一种嘌呤核苷，是RNA的结构片段，如图1所示，它在生命活动中扮演着十分重要的角色。腺苷在生物机体内参与调节多种生理和病理生理过程，存在广泛的心血管效应，多年的临床实践证实在心血管疾病诊断和治疗方面的有很高的应用价值。腺苷是一种内源性核苷，据文献报道，生命体内瘤细胞因生长速度快速，细胞容易引起缺氧和坏死，导致生物体内腺嘌呤核苷酸降解产生大量腺苷，从而为肿瘤提供了快速生长的环境，导致腺苷在生物体内浓度越来越高，蓄积在生物体内。因此，腺苷作为肿瘤和其他疾病的潜在生物标志物，在临床诊断和生物医学研究方面有十分重要意义。

目前，文献中腺苷的检测对象主要为中药，例如冬虫夏草、安喘舒丸、党参、蓝芩口服液等，有关血清中腺苷含量的检测研究较少。由于人体血清中腺苷含量很低，液相色谱检测的灵敏度远不能达到检测的要求，因此，采用液相色谱串联质谱法测定人体血浆中腺苷的含量，可以满足实验室大量、快速分析的需求[1，4]。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

液相色谱串联质谱仪(Agilent 6460 LC/MS/MS，美国安捷伦公司)；去离子水发生器(Milli-Q型，美国Millipore公司)； 乙腈、甲酸 (色谱纯，TEDIA，USA)；实验用水为Milli-Q去离子高纯水；有机微孔过滤膜(孔径0.22 μm)；腺苷(Adenosine,AD，CAS: 58-61-7,分子式：C10H13N5O4美国sigma公司)。

标准储备液：用电子天平精确称取腺苷10mg于10 mL容量瓶，用50%(v/v)的甲醇水溶解定容，配制成浓度为1mg/mL标准储备，置于-20℃冰箱保存。工作溶液根据实际需要用流动相将标准储备液稀释成适合浓度，现配现用。

1.2 样品前处理

吸取0.1mL血浆样品于1.5mL具塞离心管，加入0.9mL乙腈，涡旋1min,混匀后15000r/min冷冻离心10min，取上清液溶液过0.22μm有机系滤膜进样。

1.3 色谱、质谱条件

1.3.1 色谱条件

(1)色谱柱：HILLIC柱 (2.1×150mm，1.8μm)或柱效相当的色谱柱；

(2)流动相：流动相A(0.1%甲酸水)，流动相B(乙腈)，梯度洗脱；梯度洗脱程序为：0～2min，10%A；2～3min，10%～50% A；3～5min，50% A；5～7min，10% A；7～8.00min，10% A

(3)流速：0.3 mL/min

(4)柱温：35℃

(5)进样量：10 μL

1.3.2 质谱条件

(1)离子源：电喷雾离子源(ESI)

(2)扫描方式：正离子扫描

(3)检测方式：多反应监测(MRM)

(4)干燥气温度：350 ℃

(5)干燥气流速：10 L/min

(6)雾化器压力；40 psi

(7)毛细管电压：3000V

(8)根据仪器优化碰撞电压及定性定量离子对、保留时间及碰撞能量等参数如表1所示。

表1 多反应监测模式(MRM)参数

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

比较了0.1%甲酸水-甲醇、0.1%甲酸水-乙腈、纯水-甲醇、纯水-乙腈体系下腺苷的峰形和灵敏度，结果表明0.1%甲酸水-乙腈条件下峰形好，灵敏度高。将浓度为1.0μg/mL腺苷标准溶液分别在正、负模式下进行扫描，结果腺苷在正模式下响应较负离子模式更为稳定，因此选择正模式作为质谱的离子化模式，选择扫描方式为正离子扫描。再用浓度为1.0μg/mL腺苷标准溶液对质谱参数进行优化，获得最佳的传输电压、碰撞能等参数。优化后的多反应监测条件如表1所示。腺苷在正模式下，在ES+条件下一级质谱扫描得到[M+H]+分子离子峰，即选取m/z 268为分子离子，在不同碰撞电压下，对分子离子进行二级质谱分析，最终选择m/z 119为定性离子，m/z 136为定量离子。腺苷二级质谱图如图2所示。

图1腺苷结构式图2腺苷二级质谱图

图3m/z136定量离子MRM色谱图

图4m/z119定性离子MRM色谱图

2.2 色谱条件条件优化

腺苷是以核苷和嘌呤为基本构造的活性物质，是一种天然核苷酸，分子极性较强[5，8]。本实验在参考其他文献资料的基础上，比较了C18、HILIC及SCX三种不同型号色谱柱。腺苷由于极性较强，在C18和离子交换柱都不保留，在极性HILLIC柱上保留且峰形对称，因此最终本实验选择了waters HILLIC柱 (2.1×150mm，1.8μm)作为分离色谱柱。m/z 136定量离子和m/z 119定性离子MRM色谱图如图3、图4所示。

2.3 提取溶剂的优化选择

目前，腺苷的检验方法有液相液质等[9，10]，提取溶剂多为甲醇、甲醇-水等溶剂，但是文献中检测对象多为中药，中药中腺苷含量比血清中含量要大得多，因此多采用液相检测方法。本实验研究对象为血清，与一般样品分析差异较大，特别是前处理条件的优化，血清中主要成分为血浆蛋白、脂肪和碳水化合物等， 需要在前处理过程中尽可能除去这些物质，否则就会影响腺苷在电喷雾过程中的离子化效率，形成基质效应，影响测定结果的准确性。

本文通过比较甲醇、乙腈的提取效果，最终选择了乙腈作为提取溶剂，乙腈蛋白沉淀效果较甲醇更好，且经过冷冻离心后，能够有效去除干扰组分，同时因为本实验选择的是HILLIC柱，根据该极性柱的使用方法，流动相中有机相占的比例较大，本实验乙腈初始流动相比例为90%，与样品最终提取液中乙腈浓度相同，不需要氮吹且没有溶剂效应，缩短了检验时间，本方法前处理过程简便快捷，选择性好，回收率高，能够满足实验室血清中腺苷含量大量、快速分析检测的需求。

2.4 方法的线性范围与检出限

配制浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0μg/L的腺苷标准溶液，按照优化好的色谱和质谱条件进行检测分析，以腺苷定量离子的峰面积为y轴，腺苷标准溶液所对应的浓度为x轴，绘制腺苷标准曲线。实验结果表明，在5.0～100μg/L范围内，腺苷的定量离子的峰面积和对应的标准溶液浓度呈良好的线性关系，线性方程为：y=172.3x-1522，相关系数为0.998。一般情况下方法检出限( LOD)是以空白基质添加腺苷，进行测定，根据实验数据本实验方法的检出限为5.0μg/L。

2.5 方法的回收率与精密度

分别准确称取6组不同血清样品，并添加5.0μg/L和20.0μg/L腺苷标准溶液，按上述方法进行添加回收率试验，结果如表2所示。

表2 不同油样添加回收率及精密度

3 结 论

本实验建立了液相色谱-串联质谱法检测血清中腺苷含量，前处理方法方便快捷，选择性好，回收率高，能够满足实验室大量、快速分析血清中腺苷含量的检测，也可用于血清中腺苷浓度监测研究，为临床检验提供科学依据。