外周血长链非编码RNA-同源盒基因反义转录RNA与卵巢癌术后转归关系及意义

李 蓁， 张 帆， 蔡红兵， 卢玉兰

武汉大学中南医院 妇瘤科 湖北省肿瘤医学临床研究中心 肿瘤生物学行为湖北省重点实验室，湖北 武汉 430071

卵巢癌是妇科临床常见的恶性肿瘤之一，该病发病隐匿，临床症状不典型，确诊时多数患者已发展至中晚期，经手术或综合疗法治疗后，复发率和转移率均较高[1]。目前，卵巢癌临床诊断和预后评估最常用的分子标志物是血清糖类抗原125(carbohydrate antigen 125，CA125)，预测卵巢癌的敏感度为80%左右[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是近年来的研究热点，在肿瘤性疾病的病理研究中受到越来越多的重视[3]。有学者发现，同源盒基因反义转录RNA(homeobox transcript antisense RNA，HOTAIR)对妇科恶性肿瘤具有一定的诊断价值[4]。本研究旨在探讨LncRNA- HOTAIR与卵巢癌术后转归的关系及意义。现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取自2014年5月至2016年5月武汉大学中南医院收治的进行手术治疗的138例卵巢癌患者为研究对象。纳入标准：初诊患者，术前无放化疗或手术史；拟行以手术为主的综合治疗策略；术后病理证实为卵巢上皮性癌；临床和随访资料完整，随访时间≥20个月。本组患者年龄39～69岁，平均年龄(45.6±6.8)岁；国际妇产科协会分期：Ⅱa期10例，Ⅱb期11例，Ⅱc期9例，Ⅲa期25例，Ⅲb期29例，Ⅲc期44例，Ⅳ期10例；分化程度：高分化88例，中分化35例，低分化15例。本研究经医院伦理委员会批准，患者均签署知情同意书。

1.2 治疗方法 所有患者均行手术治疗，主要是全子宫、附件及大网膜切除术联合腹、盆腔肿瘤减灭术。其中，有31例同时行淋巴结清扫或活检术。术后进行4～8个疗程的化疗，主要化疗方案为以铂类为基础的的综合方案，其中，紫杉醇联合奈达铂49例，卡铂联合脂质体多柔比星55例，卡铂联合紫杉醇34例。

1.3 预后评估方法 患者治疗完成后2年内每3个月入院复查1次，自第3年起每半年入院复查1次，不能入院复查患者电话回访，记录患者复发率和病死率，统计截止日期为2018年5月30日。

1.4 血清CA125测定方法 分别于术前和术后6个月抽取患者空腹肘静脉血，室温静置40 min，4 000 r/min离心分离血清。采用全自动化学发光仪(上海罗氏，型号：Elecsys 2010)及其配套试剂盒测定CA125水平，阳性标准为血清CA125含量>35 U/ml。

1.5 LncRNA-HOTAIR测定方法 分别于术前和术后6个月抽取患者空腹肘静脉血，采用全血总RNA快速提取试剂盒提取外周血总RNA，经吸附柱纯化后采用荧光定量PCR实验测定LncRNA-HOTAIR的mRNA表达水平。主要步骤：(1)反转录实验生成cDNA。采用反转录试剂盒(TAKARA，RR047A)，按照试剂盒要求配置体系，置于荧光定量PCR仪进行反转录反应，反应条件为35℃×15 min，85℃×5 s，4℃保持，准备扩增。(2)所得RT产物自动进行实时定量荧光PCR反应，采用染料法荧光定量试剂盒(TAKARA，RR820A)，按照试剂盒配置体系，以U6为内参，LncRNA-HOTAIR和U6分开测定，按照试剂盒要求配置体系，应用溶解曲线观察扩增产物的特异度，扩增曲线计算mRNA表达量。

2 结果

2.1 随访结局与临床资料 随访至2018年6月1日，138例患者共复发37例，复发率为26.8%(37/138)；病死21例，病死率为15.2%(21/138)，均死于癌复发。复发患者的病理分期较高，与未复发患者比较，差异有统计学意义(P<0.05)；其他一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 复发与未复发患者临床资料比较/例(百分率/%)

注：手术Ⅰ为全子宫、附件及大网膜切除术联合腹、盆腔肿瘤减灭术；手术Ⅱ为全子宫、附件及大网膜切除术联合腹、盆腔肿瘤减灭术+淋巴结清扫或活检术

2.2 复发与未复发患者外周血标志物水平比较 术前、术后，复发组患者血清CA125阳性率、CA125水平及LncRNA-HOTAIR mRNA表达水平均高于未复发组，组间比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 复发与未复发患者外周血标志物水平比较

2.3 外周血标志物对卵巢癌术后复发的预测价值 术前、术后的血清CA125水平及LncRNA-HOTAIR mRNA表达水平对卵巢癌术后复发均有预测价值，其ROC曲线见图1。术前LncRNA-HOTAIR和CA125的最佳工作点分别为2.75和356.7 U/ml，术后最佳工作点分别为1.62和46.3 U/ml，其敏感度和特异度见表3。

3 讨论

LncRNA是一类转录长度>200个核苷酸的非编码RNA。LncRNA-HOTAIR是一类典型的反义转录RNA，其主要功能在于通过反式作用沉默染色质，对人类胚胎发育和器官构建均发挥重要的调节作用[5]。近年来，有研究发现，LncRNA-HOTAIR可通过与PRC2的相互作用沉默部分抑癌基因的转录，从而促进乳腺癌的发生发展[6]；在宫颈癌中，Li等[7]研究证实LncRNA-HOTAIR能够通过miR-23b作用于丝裂原活化蛋白激酶通路，从而促进宫颈癌的淋巴转移；在子宫内膜癌中，有研究发现，LncRNA-HOTAIR还能够调节某些抑癌基因的甲基化，并推测通过甲基化作用沉默某些抑癌基因及信号通路的表达，可能是其促进子宫内膜癌淋巴转移的重要机制之一[8]。另有研究指出，LncRNA-HOTAIR不仅参与了肿瘤的转移与复发，还参与了肿瘤细胞的多药耐药[9]。

图1 术前、术后LncRNA-HOTAIR及CA125预测术后复发的ROC曲线

指标曲线下面积P值95%可信区间敏感度特异度术前LncRNA-HOTAIR0.77900.682～0.8760.7300.721术前CA1250.83600.746～0.9260.7410.824术后LncRNA-HOTAIR0.84500.779～0.9110.6950.915术后CA1250.81500.743～0.8860.7140.703

目前，已有研究指出，LncRNA-HOTAIR能够通过多种途径介导卵巢癌的发生与发展，但多数研究是针对癌组织样本或癌细胞样本的考察[10-11]，本研究重点分析外周血LncRNA-HOTAIR与卵巢癌术后转归的关系及意义。本研究结果显示，本组138例患者术后2～3年的复发率为26.8%，基本处于国内报道范围以内。本研究对复发和未复发患者的基本资料和治疗方式进行比较，除复发组的病理分期较高外，其他资料无显著统计学差异，其中，病理分期为Ⅳ期的患者复发率高达80%。这主要是因为Ⅳ期患者往往已经侵犯临近或远端器官，肿瘤体积大，累及范围广，手术难度高，且术中肿瘤细胞脱落与定植的风险也高，已有研究证实，国际妇产科协会Ⅳ期为术后复发的高危因素[12]。CA125是目前诊断和评估卵巢癌病情的常规标志物。本研究结果显示，复发患者CA125阳性率及整体水平均高于未复发患者，这与张艳丽等[13]研究报道一致。本研究还发现复发组外周血LncRNA-HOTAIR mRNA表达水平也高于未复发组，进一步ROC曲线分析结果显示，术前、术后的CA125和LncRNA-HOTAIR 对卵巢癌术后复发均有预测价值，且敏感度均达到了较好的水平。考虑到多种标志物联合检测能提高生物标志物的临床诊断效能，LncRNA-HOTAIR不失为一种良好的辅助指标。

综上所述，外周血LncRNA-HOTAIR表达水平与卵巢癌术后转归密切相关，可作为血清CA125的辅助指标对术后复发做出预测。