骨桥蛋白在大鼠重度创伤性脑损伤后肠黏膜中表达水平变化

李景毅， 郎宇璜， 陈凤媛， 缪京丰

上海市第五人民医院1.创伤急救中心；2.消化内科，上海 200240

重度创伤性脑损伤是神经外科常见急症，具有较高的致死率和致残率[1-2]。重度创伤性脑损伤发生后，机体多个器官可出现继发性功能障碍，且互相影响，甚至出现多器官功能障碍综合征[3-5]。肠黏膜屏障损伤会继发于严重创伤、感染、休克等，可导致肠道细菌和内毒素移位，激发炎症反应，诱发和促进全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征[6-7]。骨桥蛋白是一种机体反应性蛋白，在特定的生理病理状态下，由间叶组织细胞分泌到细胞外基质中，在骨代谢、伤口愈合、血管生成、肿瘤发生、炎症免疫反应等方面发挥重要作用[8]。研究发现，多器官功能障碍综合征患者的炎症感染病理过程中，骨桥蛋白表达水平会显著升高[9]。本研究主要通过建立大鼠重度创伤性脑损伤模型，研究骨桥蛋白在重度创伤性脑损伤后肠道应激性反应中的表达水平变化趋势和在外周血中的表达特点，以及其与肠道通透性变化和部分炎性因子的相关性，从骨桥蛋白角度了解肠黏膜屏障应激性反应的免疫特点，为进一步研究重度创伤性脑损伤后肠黏膜损伤的机制和防治手段提供依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性SD大鼠24只，体质量200～250 g，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，许可证号码：SCYK(沪)2013-0016。骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6、酶联免疫吸附试验试剂盒(美国R&D公司)，荧光异硫氰酸盐葡聚糖(美国Sigma公司)；立体定位仪(美国WPI公司)，ALC-FP6液压冲击颅脑损伤仪、ALC-CED牙科钻(上海奥尔科特生物科技有限公司)，H-600透射电子显微镜(日本日立公司)，CS-31光学显微镜(日本Olympus公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组及重度创伤性脑损伤模型建立 将大鼠随机分入假手术组(n=6)和重度创伤性脑损伤组(n=18)。假手术组仅切开头皮，开骨窗，不行液压打击。重度创伤性脑损伤组参照Dixon法建立大鼠重度创伤性脑损伤模型[10]：大鼠全身麻醉后，沿头部正中线切开皮肤至骨膜，于前囟门后3.5 mm处开直径约5.0 mm的骨窗，行液压打击，致伤能量为(173.68±10.23)kPa，然后用牙托粉封闭骨窗后缝合。按照术后1、3、5 d时间点，将重度创伤性脑损伤组分为伤后1 d组、伤后3 d组、伤后5 d组3个亚组，每组6只大鼠。

1.2.2 标本采集 于伤后1、3、5 d，分别将重度创伤性脑损伤大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔内注射麻醉，剖开脑腔、胸腔及腹腔。取完整脑组织，分别以4.0%多聚甲醛固定，石蜡包埋；以2.5%戊二醛固定，EPON812包埋，制作组织标本；穿刺心脏、取血，离心分离血浆，-80℃冰箱冻存；截取回肠末段(距回盲部5 cm)组织，一部分以4%多聚甲醛溶液固定，制作组织蜡块，另一部分以液氮罐冻存。

1.3 观察指标

1.3.1 脑病理组织学观察 脑组织蜡块连续切片，HE染色，200倍光学显微镜下观察脑组织病理学变化。同时，在透射电子显微镜下观察神经元细胞和突触的形态学变化。

1.3.2 肠病理组织学评价 肠组织蜡块连续切片，HE染色，参照文献[11]对小肠黏膜损伤程度进行病理学评分。评分标准：0分，黏膜正常；1分，绒毛顶部上皮下间隙增宽；2分，上皮层与固有层呈中度分离；3分，绒毛两边呈大量分离，并伴部分绒毛顶部破损；4分，绒毛大量破损，伴固有层毛细血管显著显露；5分，固有层呈破坏、溃疡及出血。

1.3.3 肠道通透性检测 参照文献[12]，采用荧光异硫氰酸盐葡聚糖示踪法进行活体肠道通透性评价。经胃管灌入荧光异硫氰酸盐葡聚糖 400 mg/g，4 h后取血标本，采用荧光分光光度仪测定荧光强度，激发光波长480 nm，发射光波长520 nm。

1.3.4 血浆中骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6表达水平检测 酶联免疫吸附试验法测定血浆中骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的表达水平。

1.3.5 肠组织中骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6表达水平检测 将冻存的小肠组织研磨，制作组织匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液。采用酶联免疫吸附试验法测定骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的表达水平。

2 结果

假手术组脑组织血管和突触泡正常。伤后1 d组大鼠脑组织血管周围有空隙，神经元细胞有脱落现象，管腔面不清晰，内皮细胞胞浆肿胀，有空泡，部分突触泡轻度扩张；伤后3 d组大鼠脑组织血管周围出现大量空白区，血管壁变薄，突触泡扩张，部分区域融在一起，形成大片空白区；伤后5 d组大鼠脑组织血管周围出现大量空白区，血管壁变薄，突触泡扩张，形成大片空白区。见图1～2。重度创伤性脑损伤组大鼠的肠黏膜病理学评分和通透性，肠组织和血浆中骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的表达水平均明显高于假手术组，且随着伤后时间的延长而上升，各组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1～3。血浆骨桥蛋白表达与肠黏膜病理学评分、肠黏膜通透性、肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-6的表达水平具有相关性(P<0.05)。

3 讨论

肠黏膜不仅具有消化和吸收功能，还具有防御性屏障功能。肠黏膜屏障分为机械屏障、生物屏障、化学屏障及免疫屏障四部分，这四部分之间互相关联[13]。肠道内贮存着大量的细菌和内毒素，当发生重大损伤，可诱发肠黏膜屏障功能损伤，导致细菌、内毒素等突破肠黏膜屏障，进入门静脉和淋巴系统，启动全身炎症反应，甚至发展为全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征[14]。重度创伤性脑损伤继发肠黏膜屏障损伤的机制尚未完全阐明，多数学者认为重度创伤性脑损伤患者因颅内压升高，引起自主神经系统功能紊乱，导致器官血管收缩，诱发组织缺血缺氧；同时，因神经-内分泌-内分泌网络调节紊乱而出现过度炎症反应[15]。肠道对缺血-再灌注损伤极为敏感，也是过度炎症反应先受累的器官[16]。在创伤后多器官功能障碍综合征患者中，肠屏障功能受损程度与机体免疫抑制程度、病情严重程度呈正相关，是不良预后的危险因素[17-18]。有研究报道，大鼠在重度创伤性脑损伤后3、72 h，肠黏膜通透性出现两个峰值：第1个峰值可能与肠道缺血-再灌注损伤有关；第2个峰值可能与肠黏膜上皮细胞凋亡或坏死，绒毛破损，形成局灶黏膜溃疡有关[19-21]。

图1 各组光学显微镜下脑组织病理学观察(HE染色×200)

图2 各组透射电子显微镜下脑组织病理学观察(HE染色×6 000)

组别病理学评分/分荧光异硫氰酸盐葡聚糖/μg·ml-1假手术组0.38±0.1546.73±9.12伤后1 d组3.34±0.47①105.12±26.74①伤后3 d组5.12±0.85①②565.28±74.35①②伤后5 d组5.75±0.89①②③638.67±85.49①②③

注：与假手术组比较，①P<0.05；与伤后1 d组比较，②P<0.05；与伤后3 d组比较，③P<0.05

表2 各组肠组织中骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6表达水平比较

注：与假手术组比较，①P<0.05；与伤后1 d组比较，②P<0.05；与伤后3 d组比较，③P<0.05

表3 各组血浆中骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6表达水平比较

注：与假手术组比较，①P<0.05；与伤后1 d组比较，②P<0.05；与伤后3 d组比较，③P<0.05

骨桥蛋白是一种分泌型糖基化的细胞外基质蛋白，又被称为早期T淋巴细胞活化因子。骨桥蛋白在正常情况下表达甚微；但在损伤、感染、低氧等诱导因素作用下，巨噬细胞、平滑肌细胞、T淋巴细胞、成纤维细胞等都可以早期大量表达骨桥蛋白，调节细胞的趋化和粘附、细胞因子的表达、免疫应答及炎症反应等，参与机体炎症反应，发挥强效促炎作用[22-26]。本研究中，重度创伤性脑损伤组大鼠的肠黏膜病理学评分和通透性，肠组织和血浆中骨桥蛋白、肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6的表达水平均明显高于假手术组，且随着伤后时间的延长而上升，各组间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；血浆骨桥蛋白表达与肠黏膜病理学评分、肠黏膜通透性、肿瘤坏死因子-α及白细胞介素-6的表达水平具有相关性(P<0.05)。以上结果提示，骨桥蛋白可能参与大鼠重度创伤性脑损伤后肠黏膜屏障损伤的病理过程。因本研究为动物实验且样本量较少，相关结论尚需进一步研究验证。

综上所述，骨桥蛋白在大鼠重度创伤性脑损伤后肠黏膜屏障损伤的病理过程中发挥重要作用，是评价肠道通透性的一个新的潜在指标。