高效液相色谱法测定染发剂中14种染料

2018-10-12

分析仪器 2018年5期

(辽宁省分析科学研究院辽宁省标准化体系建设工程技术研究中心，沈阳 110015)

染发剂是通过改变头发颜色，达到美化毛发之目的的一类化妆品。随着社会生活水品的不断提高，人们开始注重生活质量和消费质量，染发作为美容的方式之一，越来越受到人们的青睐，城市中青少年彩色染发者逐年增多，同时中老年人群中的使用者比例也逐渐上升。世界卫生组织研究表明,长期使用染发产品可导致头发脱落、皮肤过敏、皮肤癌、恶性肿瘤、肝脏损害和泌尿系统疾病,同时某些染发剂中的染料所具有雌激素效应的该类化合物也易危害生殖系统的健康。为了保障消费者的身体健康,欧盟78/ 768/ EEC 及2003/ 15/ EC 的增补指令[1，2]、日本化妆品卫生标准，及我国《化妆品卫生规范》2015版[3]规定了染发剂中相关染料的一些检测方法。为满足国内外法规的要求,积极开展染发剂中多种类染料的检测具有重要的现实意义。对苯二胺等有机胺类染料作为典型的染料被广泛的使用在黑色染发剂中[4]。针对种类繁多的染料成分，各国科学家一直在积极的研究新的检测方法以适应不断增加的染发剂的检测要求，在检测染料这一领域，主要采用气相色谱-质谱( GC-MS )[5，6]、毛细管电泳(CE)[7]、高效液相色谱(HPLC)[8-10]和高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)[11]等分析方法，针对染料成分具有强极性，低挥发性及不稳定性的特点，HPLC是最理想的检测染料的方法。本文以磷酸盐缓冲溶液-乙腈为流动相，建立了染发剂中对苯二胺等14中染料成分的高效液相色谱法，并对市售的染发剂进行了测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent1200高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器(DAD0和自动进样器，KQ3200DE型速控超声波清洗器，Techcomp CT14RD 离心机，Sartorius BT25S电子天平。

标准品：对苯二胺、邻氨基苯酚等标准品购于Accu Standard公司；邻苯二胺、对氨基苯酚、间氨基苯酚、甲苯-2，5-二胺硫酸盐、间苯二酚、2-硝基对苯二胺、甲苯-3，4二胺等标准品购于Dr.E公司；2-氯对苯二胺硫酸盐、4-氨基-2-羟基甲苯、2-甲基间苯二酚、6-氨基间甲酚购于EPURE公司；4-氨基-3-硝基苯酚购于TRC公司。

试剂：乙腈色谱级 sigma公司购买；庚烷磺酸钠色谱级美国Tchnologies公司购买；磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸、亚硫酸氢钠和无水乙醇均为分析纯，购物北京化学试剂公司。

磷酸盐缓冲溶液(称取磷酸氢二钠1.8g、磷酸二氢钾2.8g和庚烷磺酸钠1.0g，加水溶解并稀释至1L，摇匀，再用10%磷酸溶液调节pH 至6)。

提取溶剂：50%无水乙醇水溶液。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

RP-AMIDE C16保护柱(20mm×4mm×5μm)，RP-AMIDE C16柱(250mm×4.6mm×5μm)，流速1.0mL/min,检测波长280nm，柱温25℃，进样量5μL，流动相为乙腈-磷酸盐混合溶液梯度洗脱，见表1。

表1 乙腈-磷酸盐混合溶液梯度洗脱表

1.2.2 标准溶液的配置

精密称取2-硝基对苯二胺标准品约25.0mg(精确至0.0001mg)，置10mL 容量瓶中加无水乙醇溶解并稀释至刻度，制成约2.5mg/mL的标准储备溶液；其余染料标准品各精密称取约100.0mg(精确至0.0001mg)，分别置10mL容量瓶中，加稀释液溶解并稀释至刻度，配制成约10mg/mL的标准储备溶液(甲苯-2，5-二胺硫酸盐和2-氯对苯二胺硫酸盐用2g/L亚硫酸氢钠水溶液溶解并定容；甲苯-3,4-二胺和4-氨基-2-羟基甲苯用无水乙醇定容)，储备溶液保存于4℃冰箱中。

分别用移液枪移取上述14 种染料的标准储备溶液各1.25mL(2-硝基对苯二胺移取5mL)至25mL容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，制成约500mg/L 的混合标准溶液。移取适量混合标准溶液，加稀释液稀释至所需浓度。

1.2.3 样品溶液的制备

称取挤出1cm后的样品约0.5g，置10mL具塞比色管中，加稀释液稀释至刻度，涡旋混匀1min，冰浴超声提取15min，7000rpm离心5min，取上清液用0.45μm 微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液。如溶液中染料浓度超出线性范围时，取超声提取后溶液5mL，加稀释液稀释至25mL，摇匀，7000rpm离心5min，，取上清液用0.45μm 微孔滤膜过滤，滤液作为待测溶液。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱和流动相的选择

根据目标染料成分的结构性质以及文献查阅结果，考察了Zorbax SB C18柱(250mm×4.6mm×5μm)和RP-AMIDE C16柱(250mm×4.6mm×5μm)两种色谱柱。结果表明采用RP-AMIDE C16柱(250mm×4.6mm×5μm)时，色谱峰峰形能够得到很好的改善。这是因为RP-AMIDE C16柱(250mm×4.6mm×5μm)色谱柱中含有酰胺结构，适宜分离胺类化合物，因此采用该色谱柱为分析柱。乙腈-磷酸盐体系的流动相比较适合14种染料的检测，我国《化妆品卫生规范》2015版给出的流动相比例在实际检测中发现不能很好的将邻氨基苯酚和2-氯对苯二胺硫酸盐分离，故而采取梯度洗脱模式，14种染料的分离色谱图见图1。

图1 14种染料的混合标准溶液色谱图1.对苯二胺；2.对氨基苯酚；3.间氨基苯酚；4.邻苯二胺；5.甲苯-2，5-二胺硫酸盐；6.2-氯对苯二胺硫酸盐；7. 邻氨基苯酚；8. 间苯二酚；9.2-硝基对苯二胺；10.2-甲基间苯二酚；11.甲苯-3，4-二胺；12.4-氨基-2-羟基甲苯；13.6-氨基间甲酚；14.4-氨基-3-硝基苯酚

2.2 样品溶液制备的优化

染发剂非常容易氧化，称取挤出1cm后的样品可以避免取到开口处被氧化的样品，这样可以对含量测定的结果不造成影响。涡旋后超声可以使样品混合提取更均匀更彻底。冰浴超声温度低而且比较稳定，能够使样品氧化的速度减缓。染发剂的基底成分比较复杂，低转速的离心后分层不够理想，采用7000rpm离心5min后发现分层效果理想。

2.3 方法的线性和检出限

配置10mg/L、25mg/L、50mg/L、100 mg/L、250mg/L和500mg/L系列混合标准溶液做标准曲线。以S/N=3为检出限，S/N=10为定量限，结果见表2。

表2的结果表明在10 mg/L～500mg/L质量浓度范围内，各染料成分的峰面积和对应的质量浓度具有良好的线性关系，相关系数均高于0.999。对标准溶液逐级稀释，计算信噪比(S/N)。

表2 14种染料成分的标准曲线及相关系数、检出限和定量限

2.4 方法的回收率及精密度

称取样品约0.5g，置10mL 比色管中，分别加入500mg/L 的混合标准溶液适量后，加稀释液稀释至刻度。按样品溶液制备方法制备样品(平行制备3 份)并进行检测，测得14 种染料组分的平均回收率为85%～110%之间。取100mg/L的混合标准溶液，重复进样6次，得14种染料峰面积的相对标准偏差(RSD)为1.20%～1.98%，满足分析要求。