中药复方多糖对不同MHC B-Lβ II基因型蛋鸡免疫活性的影响

刘晓婷，朱晓庆，杨 莉，马 昭，乔彦杰，张保军，谷新利，商云霞

(石河子大学 动物科技学院，新疆石河子 832003)

近年来，由于抗生素的滥用，病原体的变异，强毒株的出现等原因，在畜禽生产中普遍存在疫苗接种效果不佳或免疫失败等问题。有临床实践表明，疫苗与免疫佐剂或免疫增强剂配合使用，是疫苗发挥良好防疫效果的有效手段之一。中药多糖是从中草药中提取出的具有免疫增强、抗感染、抗病毒及调节造血功能等多种生物活性作用的成分之一，它毒副作用小，体内残留量低，具有开发成疗效确定、性质稳定及毒副作用小的免疫增强剂的前景[1]。多糖类物质是一种T细胞依赖性抗原，能被MHC II类分子处理和呈递，进而被TCR识别，参与机体细胞免疫，亦能有效激活B淋巴细胞，诱导特异性抗体产生[2]。目前已发现上百种中药多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗感染等多种生理活性，其免疫调节作用是当前研究的热点之一。

主要组织相容性复合体(MHC)参与机体内、外抗原的呈递，影响机体对疾病的抵抗力，是动物抗病育种的主要候选基因群之一[3]。有研究表明，鸡MHCB-Lβ基因多态性对机体免疫反应具有广泛的免疫调节作用，且与禽类对传染性疾病的抗性高度相关[4-5]。朱晓庆等[6]研究发现，MHCB-LβII基因HinII位点的多态性能够影响中药复方多糖有效免疫剂量的筛选。由于鸡MHCB-LβII基因多态性的存在，使得MHC II类分子接纳与递呈抗原肽有一定的选择性，导致不同基因型个体对同一抗原表现出免疫应答强弱的差异。另外，中医药自古讲求用药个体化，因此中药多糖作为调节机体免疫的外源性抗原之一，根据机体遗传变异的特性给予不同剂量的中药多糖，对保障疫苗效力、增强动物机体免疫力及提高其存活率有着重要意义。

本试验拟排除因MHCB-LβII基因多态性而导致的不同基因型个体免疫应答能力的差异，确定中药复方多糖能显著增强鸡机体免疫力的最佳剂量，从而为临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验药物

中药复方多糖由石河子大学中兽医学研究室提供。复方由当归、党参、川芎、熟地、山楂、何首乌、淫羊藿、麦冬、茯苓、补骨脂与黄芪11味中药按一定配比组成，经水提—醇沉法得到中药复方多糖粗提物后，再由AB-8大孔吸附树脂吸附，最终得到质量分数为77.10%的精制复方多糖。用灭菌超纯水将复方多糖配制成50 mg/mL(高剂量)、25 mg/mL(中剂量)和12.5 mg/mL(低剂量)3个质量浓度，4 ℃保存，备用。

1.2 主要试剂

白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素(IL-15)ELISA试剂盒均购自上海蓝基生物科技有限公司；鸡传染性法氏囊病毒抗体(IBDV Ab)试剂盒购于江苏绿叶生物科技有限公司；鸡新城疫病毒(La Sota株)、传染性支气管炎病毒(M41株)二联灭活疫苗，购自普莱柯生物工程股份有限公司；鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗(La Sota 株+H120株)及鸡传染性法氏囊病活疫苗(B87株)均购自哈药集团生物疫苗有限公司；禽流感二价灭活疫苗(H5N1 Re-6株+H9N2 Re-2株)购自哈尔滨维科生物技术开发公司。

1.3 试验动物及分组

500羽1日龄京红1号蛋鸡，购自新疆昌吉市某一孵化场。根据MHCB-LβII基因第2外显子PCR-SSCP的检测结果分组，再将各组分为高、中、低剂量中药多糖组和空白对照组。分别于8日龄肌肉注射50、25、12.5 mg/mL的中药复方多糖和生理盐水，每只0.2 mL，连续注射7 d。

所用试验鸡1日龄马立克疫苗喷雾免疫(于孵化场进行)，7日龄新、传二联活疫苗点眼免疫，21日龄新、传二联活疫苗点眼与新、传二联灭活苗肌注免疫，14日龄法氏囊疫苗滴口免疫，28日龄禽流感二联灭活苗免疫。在相同条件下常规饲养，饲养条件、营养水平和饲养管理均一致，饲养期为7周，整个试验期鸡群健康状况良好。

1.4 PCR-SSCP基因型检测

1.4.1 基因组DNA的提取 翅下静脉采血每羽0.2 mL，置于肝素钠抗凝采血管中摇匀，-20 ℃冷冻保存。用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，-20 ℃保存，备用。

1.4.2 引物设计与合成 根据GenBank中收录的鸡MHCB-LβII基因序列(NO.M29763.1)，应用Oligo软件设计引物，引物序列为上游引物：5′-AAACCGACCGTCTGGCGTGCTA-3′，下游引物：5′-TTACCCCACGCCTGGCTGAT-3′，扩增片段238 bp，引物由华大基因科技股份有限公司合成。

1.4.3 PCR扩增 PCR扩增体系20 L：2×PCR Mix 10 L，模版DNA 2 L，上、下游引物各0.5 L，ddH2O 7 L。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；94变性40 s，60.5 ℃退火45 s，72 ℃延伸35 s，32个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取5 L PCR 扩增产物由20 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统观察并拍照。

1.4.4 PCR-SSCP分析及序列测定 取3 L PCR产物加7 L 变性上样缓冲液[体积分数为98%去离子甲酰胺、10 mmol/L EDTA (pH 8.0)、0.5 g/L溴酚蓝]，98 ℃变性10 min，变性结束后迅速置于冰上冰浴10 min。用10 %聚丙烯酰胺凝胶[m(Acr)∶m(Scr)=29∶1]电泳检测，300 V电压预电泳10 min，120 V电泳14 h后，固定、银染、显色，判定基因型，拍照保存。各取3个不同基因型个体的PCR产物进行纯化回收，送华大基因科技股份有限公司进行测序，对PCR-SSCP分型结果进行进一步验证。

1.5 检测项目及方法

每组随机抽取5只试验鸡，于21、27、35、42、49日龄翅下静脉采集非抗凝血3 mL，37 ℃静置1 h，分离血清，测定血清中IL-1β、IL-10、IL-15的质量浓度和IBDV 抗体效价(均严格按照试剂盒说明书进行操作)。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析和多重比较，以“平均数±标准差”表示数据。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增结果

用所设计的引物对基因组DNA进行扩增，取所得PCR产物5 L于20 g/L琼脂糖凝胶上进行电泳检测，扩增产物检测结果如图1所示。由图1可看出，所设计引物的扩增结果较好，片段长度与预期238 bp大小一致，条带清晰，无非特异性条带，可直接进行SSCP分析。

2.2 SSCP检测

对所有DNA样本的PCR产物进行SSCP多态性检测，发现所扩增片段有3种基因型，分别定义为AA (103羽)、BB(266羽)和BC(131羽)(图2)。

M. Trans DNA maker I；1～7. 不同样本个体MHCB-LβII基因扩增产物MHCB-LβIIgene amplification product of different sample individual

图1MHCB-LβII的PCR扩增结果
Fig.1ThePCRamplificationresultsofMHCB-LβII

1、6、8、10.BC型 BC genotypes；2、4、7、9.BB型 BB genotypes；3、5：AA型 AA genotypes

2.3 不同基因型测序结果

选取不同基因型个体的PCR产物各3个，纯化后送华大基因科技股份有限公司进行测序。结果显示，在扩增位点有3种等位基因，分别为A、B和C，基因型有AA、BB和BC型，未检测到AB和CC型。其中AA型与GenBank(No.M29763.1)发表的序列一致，定义为野生型。BB型与AA型相比有一处T1722C的单碱基突变，BB型与BC型相比有一处A1967T单碱基突变。

2.4 中药复方多糖对不同基因型鸡血清中IL-1β、IL-10和IL-15质量浓度的影响

2.4.1 对IL-1β质量浓度的影响 由表1可知，与对照组相比，高、中、低3个剂量的中药复方多糖均能显著提高不同基因型鸡血清中IL-1β 的质量浓度，但不同基因型鸡中最有效地提高其血清中IL-1β 质量浓度所需的中药复方多糖剂量不同。其中，AA基因型鸡中，各日龄中剂量多糖组血清中IL-1β的质量浓度显著高于高、低剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡，各日龄高剂量多糖组血清中IL-1β的质量浓度显著高于中、低剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡，除27日龄高剂量多糖组血清中IL-1β 的质量浓度显著高于低剂量组外，其余日龄各剂量多糖组间均无显著差异(P>0.05)。

2.4.2 对IL-10质量浓度的影响 由表2可知，与对照组相比，高、中、低3个剂量的中药复方多糖均能显著降低不同基因型鸡血清中IL-10 的质量浓度。其中，AA基因型鸡中，21、27和35日龄时，中剂量多糖组血清中IL-10的质量浓度显著低于高、低剂量组(P<0.05)，42日龄时，中剂量多糖组低于高、低剂量组，但无显著水平(P>0.05)；BB基因型鸡中，除49日龄外，其他各日龄高剂量多糖组血清中IL-10显著低于中、低剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，各剂量多糖组间血清中IL-10无显著差异(P>0.05)。

2.4.3 对IL-15质量浓度的影响 由表3可知，与对照组相比，高、中、低3个剂量的中药复方多糖组均能显著提高不同基因型鸡血清中IL-15 的质量浓度。在AA基因型鸡中，27、35和42日龄时中剂量多糖组血清中IL-15质量浓度显著高于高、低剂量组(P<0.05)，其他各日龄均高于高、低剂量组，但无显著差异(P>0.05)；在BB基因型鸡中，27、35和42日龄高剂量多糖组血清中IL-15 质量浓度显著高于中、低剂量组(P<0.05)；在BC基因型鸡中，各剂量多糖组间血清中IL-15质量浓度无显著差异(P>0.05)。

2.5 中药复方多糖对不同基因型鸡血清中IBDV抗体效价的影响

由图3可知，在传染性法氏囊疫苗首免后7～35 d，试验组及对照组鸡血清IBDV抗体效价均呈升高趋势，且与对照组相比，首免后13～35 d，高、中、低3个剂量的中药复方多糖组均能显著提高不同基因型鸡血清中IBDV抗体效价，但不同基因型鸡中，最有效提高其血清中IBDV 抗体效价的中药复方多糖剂量不同。其中，AA基因型鸡中，中剂量多糖组鸡血清中IBDV 抗体效价显著高于高、低剂量组(P<0.05)；BB基因型鸡中，高剂量多糖组鸡血清中IBDV 抗体效价显著高于中、低剂量组(P<0.05)；BC基因型鸡中，各剂量多糖组间鸡血清中IBDV 抗体效价无显著性差异(P>0.05)。

表1 不同MHC B-Lβ II基因型蛋鸡血清中IL-1β的质量浓度Table 1 Serum levels of IL-1β in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

注：同基因型组中，同列数据后不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下表同。

Notes: In the same genotype group,different lowercase letters in the same column mean significant difference (P<0.05). The same below.

表2 不同MHC B-Lβ II基因型蛋鸡血清中IL-10的质量浓度Table 2 Serum levels of IL-10 in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

表3 不同MHC B-Lβ II基因型蛋鸡血清中IL-15的质量浓度Table 3 Serum levels of IL-15 in different MHC B-Lβ II genotype hens pg/mL

图3 不同基因型鸡血清中IBDV抗体效价的比较Fig.3 Comparison of serum titers of IBDV antibodies in different genotypes of hens

3 讨 论

鸡MHCB-LβII基因丰富的多态性与机体的免疫性状相关，能引起不同个体对相同抗原的不同的免疫反应[5]。研究表明，不同MHCB-LβII基因型鸡对肠炎沙门氏菌、流感性布鲁氏杆菌、绵羊红细胞、禽流感和新城疫等的抗体滴度，及机体内淋巴细胞活性与细胞因子质量浓度等有所不同[7]。李福伟等[5]对3个地方鸡种的MHCB-LβII基因遗传变异与绵羊红细胞、禽流感和新城疫等免疫性状进行分析，发现个体甚至品种水平上存在免疫能力的差异。杨红洋等[8]研究表明，不同MHCB-LβII基因型白羽肉鸡血清中IL-2、IL-4、IL-6、IFN-γ 和TNF-α的质量浓度不同。本试验的空白对照组中，不同MHCB-LβII基因型鸡血清中IL-1β、IL-10和IL-15质量浓度及IBDV抗体效价均有不同，提示MHCB-LβII基因的多态性与部分机体免疫活性具有相关性，能够导致机体免疫功能具有个体差异。

细胞因子是由细胞分泌的一类能够执行信号传导的蛋白活性分子，可促进靶细胞的增殖、分化和成熟，在抗感染、调节机体的免疫应答和炎症反应中起着重要的作用[9]。IL-1β是IL-1的主要亚型之一，具有高度生物活性，可以诱导淋巴细胞的增殖分化，刺激抗体产生，调节免疫作用等[10]。IL-10是一种由Th2细胞产生的抑制炎症应答的免疫抑制细胞因子，其能够通过降低抗原提成细胞(APC)表面MHC II分子及CD80+和CD86+等共刺激分子的表达，抑制Th1细胞产生IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)等促炎因子等各种途径降低APC抗原提成能力，间接降低T细胞的激活，诱导T细胞的免疫耐受[11-12]。IL-15是机体重要的促炎因子，其受体分布于树突细胞、自然杀伤细胞及CD8+T细胞，不仅可激活先天性免疫反应，而且对后续的获得性免疫具有进一步的调控作用[13]。

研究表明，植物多糖能够通过TLR4、TLR2受体激活免疫细胞内信号通路提高转录水平，促进细胞因子的分泌，从而发挥免疫调节作用[14]。李馨[15]研究表明，北冬虫夏草多糖可以增加脾脏IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA的表达量且随剂量的增加而增加，从而增强机体免疫力。江泽波等[16]研究表明，猪苓多糖可通过TLR4信号通路活化M1巨噬细胞，剂量依赖性的上调IL-1β、IL-6和TNF-α 的分泌量，从而起到增强机体免疫力的效应。马振乾[17]研究表明，沈氏免疫增强剂能抑制雏鸡血清中IL-10的分泌，从而降低其在血清中的质量浓度。王永伟[18]研究表明，鸡IL-15能够维持IBDV VP2蛋白诱导的中和性抗体的持续时间。本研究发现，中药复方多糖组各基因型鸡血清中IL-1β和IL-15的质量浓度与对照组比较均有显著提高，与李馨、江泽波等报道多糖能够上调IL-1β mRNA表达量和IL-1β 分泌量的结果相似。但本研究中复方多糖对提高血清IL-1β 的不同基因型鸡最佳剂量不同，除对BB基因型鸡呈剂量依赖性提高血清中IL-1β 外，对AA和BC基因型鸡血清中IL-1β 并不呈剂量依赖性提高。同时中药复方多糖组与对照组相比均能显著降低各基因型鸡血清中IL-10的质量浓度，此结果与马振乾等的研究一致。出现不同剂量中药复方多糖对调节鸡血清中细胞因子的最适基因型不同的原因可能是：不同MHCB-LβII基因型鸡机体的免疫系统对中药多糖类外来抗原的感知存在数量与浓度上敏感性的差异，过高或过低剂量的中药多糖均不会产生较好的免疫应答，从而引起细胞因子质量浓度的差异。

在通过疫苗接种的方式对传染性法氏囊疾病进行防治的同时，辅以免疫增强剂可有效提高疫苗接种的成功率，法氏囊抗体效价是反应法氏囊疫苗免疫后鸡特异性免疫功能的指标。王宏军[19]以饲料添加剂的方式投喂不同剂量的五味子多糖，发现多糖能显著提高新城疫疫苗与传染性法氏囊疫苗抗体效价，增强雏鸡的特异性免疫。杨靖松等[20]通过饮水给予不同浓度的党参粗提物，发现其能提高青脚麻鸡血清中IBDV的抗体效价，且以中剂量药效为佳。王福传等[21]研究表明，以黄芪、党参、当归、白术、茯苓、砂仁、陈皮和甘草组成的复方中药免疫增强剂能够有效提高蛋鸡血清中IBDV抗体效价。本研究结果显示，与对照组相比不同剂量的中药复方多糖均可显著提高IBDV抗体效价，与王宏军、杨靖松、王福传等研究结果一致。但在同一基因型同一时间内，不同剂量的中药复方多糖组中，鸡血清中IBDV 抗体效价不同，这可能与MHCB-LβII基因多态性使机体存在免疫应答能力的个体差异，导致机体同一剂量中药复方多糖组中，提高鸡血清中IBDV 抗体效价最适基因型不同。与此同时在本试验中发现，随着日龄的增加鸡血清中IBDV 抗体效价逐渐上升，在首免后13～20 d上升速度最快，而首免后20～35 d上升速度较慢，且不同复方多糖剂量组中鸡血清中IBDV 抗体效价上升速度略有不同。其原因一方面可能与法氏囊活疫苗抗体消长规律有关，在法氏囊首免后2周左右可以产生大量抗体。另一方面可能与中药复方多糖在机体内的代谢过程有关。在此过程中多糖被降解成寡糖、低聚糖等小分子形式被 MHC class II 类分子提呈给 T 细胞而发挥免疫效应。多糖的浓度不同，且机体对多糖降解、吸收和代谢速度的不同，多糖在体内被降解成小分子糖的种类和数量的不同， 以及MHC class II 类分子提呈多糖分子的数量与能力不同，导致机体血清中IBDV 抗体效价上升速度不同。

从上述试验研究结果可以看出，不同MHCB-LβII基因型鸡个体之间存在免疫应答能力的差异，且在不同基因型鸡中，最有效地提高机体免疫力的中药多糖剂量略有不同。而本次试验中，仅仅研究了京红1号蛋鸡，且鸡的数量及免疫相关指标均较少，所以要确定中药复方多糖最适免疫剂量的筛选是否受鸡基因多态性的影响，还需增加鸡的品种，扩大试验鸡的数量，增加体内、体外免疫指标，进行深入研究。