猪瘟病毒结构蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

袁 莉，杨顺利，尚佑军，贾怀杰，景志忠，刘湘涛，蔡建平,尹双辉

(中国农业科学院 兰州兽医研究所，家畜疫病病原生物学国家重点实验室， 兰州 730046)

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一种猪的高度接触性传染病，除北美洲和大洋洲外几乎遍及全世界，是危害养猪业安全的重要疫病之一。CSFV属于黄病毒科 (Flaviviridae) 瘟病毒属 (Pestivirus) 成员，基因组为单股正链RNA，大小约12.3 kb，仅编码 1 个开放性阅读框(ORF)[1-2]。CSFV基因组编码C(P14)、E0(gp44/48)、E1(gp33)和E2(gp55)4个结构蛋白，C为核衣壳蛋白，其他均为囊膜糖蛋白。E2是CSFV最重要的具有免疫原性的蛋白之一，诱导机体产生的中和抗体可以抵抗病毒感染，是研究新型基因工程疫苗和血清学抗体检测方法的首选靶蛋白。E0不仅具有RNase催化活性，在病毒复制和致病力方面也发挥作用，并能够诱导机体产生中和抗体，是CSFV的重要免疫相关抗原。CSFV感染或疫苗免疫后诱导产生的中和抗体可以抵抗CSFV强毒攻击。因此，E0蛋白在重组疫苗和诊断方法研制方面同样具有广阔的应用前景[3]。E1蛋白功能的研究鲜见报道，它常与E2形成异源二聚体并包埋在病毒囊膜内层，不能诱导机体产生中和抗体，目前还未发现病毒免疫血清中有E1抗体的存在，但对病毒的毒力有一定影响，并参与病毒粒子基本结构的组成[4-5]。C蛋白是CSFV编码的第一个结构蛋白，构成病毒的核衣壳，在病毒的增殖过程中发挥重要作用[6]。研究发现，C蛋白上存在的抗原表位对T、B淋巴细胞介导的免疫反应有重要作用，但不能诱导机体产生中和性抗体[7]。己经证实与CSFV同科的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的C蛋白具有免疫原性[8]，丙型肝炎病毒的C蛋白已经被用于临床感染治疗和疫苗研发[9]。由此推测CSFV的C蛋白可能具有与之相似的免疫学特性和功能，可以尝试利用C蛋白作为包被抗原建立ELISA检测方法。本研究以大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达、纯化和鉴定后具有良好免疫反应性的CSFV结构蛋白E0和C作为包被抗原，分别建立CSFV血清抗体的间接ELISA检测方法，同时结合已经建立的重组E2蛋白作为抗原的间接ELISA检测方法，分别对猪瘟疫苗免疫后不同时间点的血清样品进行抗体检测，分析疫苗免疫后血清中针对3种结构蛋白的抗体消长变化特点，为临床猪瘟疫苗免疫程序的制定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

猪外周血淋巴细胞分离液购自北京索莱宝科技有限公司；RNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；反转录试剂盒购自TaKaRa公司；胶回收试剂盒购自美国OMEGA公司；酶标板购自美国Coster公司；脱脂奶粉为Difco公司产品；HRP酶标记抗体、E0和C蛋白抗体阳性血清，猪瘟阴、阳性血清以及PCV2、PRRSV、PRV和BVDV阳性血清均为中国农业科学院兰州兽医研究所猪禽消化道感染和黏膜免疫研究创新团队实验室保存；其他常规试剂为国产或进口分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 试验动物分组与免疫 选取由中国农业科学院兰州兽医研究所畜禽重要人兽共患病创新团队培育的11头猪瘟抗体阴性蕨麻猪作为试验动物，按照疫苗使用说明接种，其中8头用猪瘟兔化弱毒活疫苗免疫，颈部肌肉深部注射，3头作为阴性对照。免疫前采血(0天)，随后分别在免疫后第7、14、21、28、35和50天采集抗凝血和非抗凝血各1 份，非抗凝血室温静置凝集析出血清，分装后-20 ℃保存。

1.2.2 猪瘟疫苗免疫猪外周血淋巴细胞中 E2基因的RT-PCR检测 从免疫后定期采集的抗凝血中分离外周血淋巴细胞，提取总RNA，利用RT-PCR扩增CSFV E2基因[10]。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并切胶回收目的片段进行序列测定与分析。

1.2.3 CSFV E2抗体检测 用已建立的重组E2蛋白作为抗原的间接ELISA方法检测免疫后采集的血清样品，每份样品做3个重复[10]。

1.2.4 E0和C抗原制备 CSFV 重组E0蛋白的表达纯化和抗原制备参照文献[11]。C抗原制备简要过程如下：0.5 mmol/L IPTG 37 ℃条件下诱导表达C蛋白，超声波裂解菌液。向超声波裂解后的沉淀中加入8 mol/L 尿素，室温作用 30 min 裂解沉淀，7 000 r/min离心20 min，收集上清；将纯化后的蛋白转移至含 8 mol/L尿素的复性液(20 mmol/L Tris·HCl pH 8.0，0.5 mmol/L argnine，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L GSH， 1 mmol/L GSSG)中进行透析，然后将复性液换成含有1 mmol/L GSH和1 mmol/L GSSG的 Tris·HCl(pH 8.0)继续透析6 h，最后用PBS透析过夜，离心并收集上清，并进行SDS-PAGE 蛋白电泳和Western blot鉴定。

1.2.5 间接ELISA检测 分别用纯化的E0和C作为包被抗原，建立CSFV-E0和CSFV-C抗体间接ELISA检测。方法如下：用碳酸盐缓冲液 (pH 9.6) 稀释抗原，包被ELISA反应板，每孔100 μL，4 ℃孵育过夜，1×PBST (pH 7.4) 洗板4次，拍干；每孔200 μL封闭液，室温作用30 min，洗板同前；用血清稀释液 (1×PBST, 50 g/L 脱脂奶粉，pH 7.4) 稀释阴、阳性对照血清和待检血清样品，每孔100 μL，37 ℃孵育60 min，洗板；1×PBST稀释HRP标记抗猪二抗，每孔100 μL，37 ℃作用60 min，洗板；每孔100 μL TMB-H2O2-柠檬酸盐缓冲液，37 ℃避光作用15 min；每孔100 μL 2.0 mol/L H2SO4终止液，混匀，读取450 nm吸光度值。

1.2.6 间接ELISA条件优化 采用棋盘滴定法滴定抗原、血清和酶标二抗的工作浓度。用碳酸盐缓冲液将抗原分别做1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600和1∶3 200倍稀释并包被ELISA反应板；猪瘟阴、阳性血清用血清稀释液做1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100 稀释；酶标二抗以1∶50、1∶100、1∶150、1∶200、1∶250、1∶300、1∶350、1∶400稀释。按照“1.2.5”操作步骤，测定每孔OD450nm值，根据阳性标准血清OD450nm/阴性标准血清OD450nm(P/N)最大原则，确定抗原、血清和酶标二抗最佳稀释度，并以此法优化间接ELISA各步反应的条件。

1.2.7 间接ELISA判定标准的确定 利用实验室保存的40份猪瘟阴性血清样品作为样品盘，确定间接ELISA的判定标准。统计学分析测定的OD450nm吸光度值，计算平均值(X)和标准差(SD)，样品OD450nm

1.2.8 ELISA-C和ELISA-E0抗体间接ELISA检测的特异性和敏感性 分别利用 2 种间接ELISA检测PCV2、PRRSV、PRV和BVDV阳性血清，同时以CSFV阴性和阳性血清作为对照，每个样品做3个重复，确定ELISA方法的特异性。将E0和C蛋白抗体阳性血清做1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640稀释，研究2种间接ELISA方法的敏感性。

1.2.9 CSFV E0和C 抗体检测 利用建立的CSFV-E0和CSFV-C抗体间接ELISA方法分别对不同时间点采集的免疫猪血清进行抗体检测，每个样本做3个重复，统计学分析检测结果。

2 结果与分析

2.1 猪瘟疫苗免疫猪外周血淋巴细胞中 E2基因检测

在疫苗免疫后第 7 天和第 14 天，从 8 头试验猪外周血淋巴细胞中均扩增到大小约700 bp 的 E2基因片段(图1)，目的片段切胶回收进行序列测定，在GenBank中比对证实为猪瘟疫苗株 E2基因。从14 d以后的样品中均未扩增得到此基因片段。

M.DNA marker DL 2000; 507～958. 8头疫苗免疫猪编号 8 vaccinated pigs

2.2 CSFV-E2抗体消长特征

用CSFV-E2抗体间接ELISA方法检测免疫后不同时间点采集的血清样品，并进行统计学分析，当样品值(S)/阴性值(N)>2.1时，CSFV-E2抗体判定为阳性，反之为阴性。检测结果显示，空白对照组均为阴性。试验组在免疫后第7天时血清E2抗体阳性，在免疫后第21天时达到峰值，之后开始下降，总体呈现先上升后下降的变化趋势(图2)。

2.3 CSFV-E0抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

2.3.1 抗原、血清和酶标二抗的最佳稀释度 利用棋盘滴定法确定E0蛋白的最佳包被质量浓度为2.09 μg/mL，标准阳性血清、标准阴性血清和田间检测血清样品稀释度均为1∶60，酶标记抗体的稀释度为1∶100。

2.3.2 结果判定标准 对40份CSFV抗体阴性猪血清的检测数据进行统计学分析，得平均值X=0.31，标准差SD=0.044，计算得X+2SD=0.40，因此，本次检测中血清样品OD450 nm<0.40 为抗体阴性，反之为阳性。

图2 猪瘟疫苗免疫后CSFV E2抗体变化特征Fig.2 Dynamics of E2 antibody after CSFV C-strain vaccination in pig serum

2.3.3 特异性和敏感性 特异性试验结果显示，PCV2、PRRSV、PRV和BVDV阳性血清与E0抗原无交叉反应，说明本方法具有良好的特异性(表1)。用该方法检测1∶40、1∶80、1∶160、1∶320、1∶640稀释的阳性血清时，当稀释度为1∶640 时，结果为阴性，表明敏感性良好。

表1 CSFV-E0抗体间接ELISA检测的特异性试验Table 1 Specificity results of CSFV-E0 indirect ELISA

注：数据为“平均值±标准差”。下同。

Note: The data in the table are repetitive “mean±standard deviation”. The same below.

2.3.4 CSFV E0抗体的产生特征 用CSFV-E0抗体间接ELISA方法检测疫苗免疫后不同时间收集的血清样品，结果显示，对照组OD450nm值均小于阴阳性临界值 0.38，均为阴性。试验组在疫苗免疫后第 7 天即可检测到E0抗体，在第 21 天时达到最高水平，免疫 21 d后有所下降并最终趋于稳定(图3)。

图3 猪瘟疫苗免疫后CSFV E0抗体变化特征Fig.3 Dynamics of E0 antibody after CSFV C-strain vaccination in pig serum

2.4 CSFV-C抗体间接ELISA检测方法的建立及评价

2.4.1 SDS-PAGE和Western blot鉴定重组C蛋白 表达的C蛋白以包涵体形式存在，大小约20 ku。Western blot结果显示，其能够被CSFV C阳性血清识别(图4)。

2.4.2 抗原、血清和酶标二抗最佳稀释度 利用棋盘滴定法确定C蛋白最佳包被质量浓度为1.59 μg/mL，标准阳性血清、标准阴性血清和待检测血清样品最适稀释度均为1∶80，酶标记抗体的稀释度为1∶350。

M. 蛋白质分子质量标准 Protein marker; 1. 纯化前的重组C蛋白 The recombinant C protein before purification; 2. 纯化后的重组C蛋白 Purified recombinant C protein; 3. 重组C蛋白的Western blot检测 Analysis C protein with Western blot

图4SDS-PAGE和Westernblot鉴定重组C蛋白
Fig.4AnalysisofrecombinantCproteinwithSDS-PAGEandWesternblot

2.4.3 结果判定标准 对40份CSFV抗体阴性猪血清样品检测数据进行统计学分析，计算得平均值X=0.51，标准差SD=0.077，X+2SD=0.66，因此，血清样品的OD450nm<0.66时判为抗体阴性，反之为阳性。

2.4.4 特异性和敏感性 特异性试验结果显示，PCV2、PRRSV、PRV和BVDV阳性血清与C蛋白无交叉反应，表明特异性良好(表2)；用CSFV-C间接ELISA方法检测连续稀释的CSFV阳性血清，当稀释至1∶320时，结果为阴性，表明敏感性良好。

表2 CSFV-C抗体间接ELISA检测的特异性试验Table 2 Specificity results of CSFV-C indirect ELISA

2.4.5 CSFV C抗原的抗体消长规律 用CSFV-C抗体间接ELISA方法检测猪瘟疫苗免疫的血清样品，结果显示，对照组OD450nm值均小于阴阳性临界值0.63，均为阴性。试验组疫苗免疫后第7天检测到抗C蛋白抗体，在第28天时抗体转阴(图5)。

图5 猪瘟疫苗免疫后CSFV C抗体消长规律Fig.5 Dynamics of C antibody after CSFV C-strain vaccination in pig serum

3 讨 论

E2是CSFV最重要的免疫功能蛋白，含有B、T细胞表位，可以诱导中和抗体的产生，是主要的保护性抗原[12-14]。E2蛋白N 端氨基酸残基 690～866包含4个相对独立的抗原结构域，分别是 A、B、C 和D，其中A、B、C区对于中和抗体的产生发挥主要作用[15]。猪感染CSFV或疫苗免疫后也可以产生针对E0的中和抗体，E0作为CSFV的次要免疫相关抗原，在CSFV感染过程中必不可少。C蛋白是构成病毒粒子的一种外壳蛋白，在病毒繁殖过程中发挥重要作用。因此可以通过检测疫苗免疫后血清中E2、E0和C蛋白的抗体产生情况反映CSFV疫苗的免疫效果。

目前，国内CSF防控主要还是采取猪瘟兔化弱毒疫苗预防接种，定期对免疫后猪群进行抗体检测，评估疫苗免疫效果，改进和优化免疫程序，有助于猪瘟的防控。在猪瘟病毒血清抗体检测实际工作中，因ELISA方法具有操作简单、节省时间、特异性和灵敏性良好及适用于大规模样本检测等优点，已成为临床使用最广泛的技术手段。已有诸多利用 E2 或 E0 蛋白作为抗原的 ELISA 方法被研发出来[16-19]，这些方法在CSF防控或消灭中发挥重要作用。

本研究中，猪瘟疫苗免疫后，仅从免疫猪第7天和第14天的外周血淋巴细胞中检测到CSFV E2基因片段，21 d及以后的时间点均未能检测到，说明本次试验中，疫苗毒在猪体内存在时间不超过21 d，再次证明猪瘟弱毒疫苗安全性良好，不存在持续性感染的危险[20]。在用CSFV-E2抗体间接ELISA方法对疫苗免疫后不同时间点采集的血清样品进行检测时发现，免疫后第7天E2抗体转阳，在第21天时达到最高峰，总体呈现先上升后下降的趋势，结果与相关研究报道基本一致[21-23]。采用建立的CSFV-E0抗体和CSFV-C抗体间接ELISA方法分别检测疫苗免疫后不同时间点血清样品，结果显示，在CSFV 3 个结构蛋白诱导产生的抗体中，C抗体产生最早，消失最早。C蛋白作为病毒的核衣壳蛋白，其抗体主要存在于病毒感染早期，随着C抗体水平的下降，E2和E0抗体水平开始上升，C抗体消失后，E2和E0抗体达到最高水平，对免疫猪发挥保护作用。本次动物试验还发现，单次疫苗免疫后第7天即可检测到E2、E0和C蛋白的相应抗体，猪体免疫应答产生迅速，但抗体水平随着时间的延长均会有所降低，因此临床上有必要根据抗体变化适时加强免疫，确保猪群安全。

2017年，中国历史上首个猪瘟基因工程疫苗，即猪瘟病毒 E2 蛋白重组杆状病毒灭活疫苗(Rb-03株) 获得批准，该重组疫苗只诱导猪体产生抗E2蛋白抗体，因此，可以通过检测针对CSFV其他蛋白的抗体来区分野毒感染和疫苗免疫，该疫苗为中国的猪瘟净化奠定基础。本研究建立的检测CSFV结构蛋白E0和C抗体的ELISA方法可以作为鉴别感染和免疫的候选方案，为中国猪瘟的净化提供技术支持。