长链非编码RNA H19靶向miR-141调控卵巢癌细胞的迁移和侵袭行为①

赵雪卉 刘宗印 毛红妮

(陕西省宝鸡市妇幼保健院,宝鸡721000)

卵巢癌是全球第二常见的女性恶性肿瘤，也是女性恶性肿瘤中最常见的死亡原因[1]。随着时代的发展，尽管手术和其他治疗方式有所改善，但由于卵巢癌诊断较困难，晚期卵巢癌患者的治疗效果和预后很差[2,3]。因此，研究并阐明卵巢癌发生的分子调控机制，研究发现用于卵巢癌诊断和靶向治疗的新型生物标志物是目前的主要方向。

长链非编码RNA是近年来在哺乳动物中广泛存在的调控因子，非编码RNA(lncRNA)在多种细胞的基因调控中具有重要作用，可以参与细胞本身的生长周期和增殖调控[4,5]。目前已有研究发现lncRNA在调节细胞生物学功能和相关基因表达的过程中起到促进或抑制的作用[6]。lncRNA和其他miRNA不完全相同，经过深入研究lncRNA发现其可以和miRNA相互结合形成新的复合物，对下游调控元件进行直接调控，参与肿瘤细胞生长过程[7]。

Lai等[8]提出长链非编码RNA和信使RNA之间的相互作用，形成由lncRNA介导的复杂转录因子调控网络，通过共享一个或多个miRNA应答元件，参与蛋白质编码过程，调节彼此的表达情况。同时Shi等[9]证明了在乳腺癌患者体外和体内lncRNA和mRNA相互作用的存在，可以直接调控乳腺癌细胞的生长，并可以作为临床患者的预后检测指标。据报道，lncRNA H19在卵巢癌中的表达明显上调，可以通过竞争与miR-133和miR-135的结合来调节肿瘤细胞的分化，并可以促进细胞侵袭，减少细胞凋亡数目[10]。而miR-200家族(包括miR-200a、miR-200b、miR-200c、miR-141和miR-429)也被证明可以抑制ZEB1的表达并上调E-钙黏蛋白，参与肿瘤细胞的生长发育过程[11]。

本研究中，通过检测lncRNA H19和miR-141的表达情况，进一步探讨lncRNA H19和miR-141对下游蛋白的影响作用，通过对卵巢癌细胞生物学行为的作用，明确lncRNA H19和miR-141在卵巢癌中可能的作用机制。可能为卵巢癌的诊治提供一个潜在的新靶标。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1临床标本 收集2016年7月～2017年1月在医院手术切除并且经病理检查确诊为卵巢癌的组织50例，同时取癌旁正常卵巢组织50例。离体后放入4%多聚甲醛中固定。全部患者术前无化疗或放疗，卵巢癌为原发病灶并经病理科证实，患者签署知情同意书。

1.1.2细胞株与主要试剂 人卵巢癌ES-2、COC1和SKOV3细胞株均购自武汉大学中心细胞库。细胞在含10%胎牛血清的RPMI1640、37℃、5%CO2条件下培养。胎牛血清，RPMI1640培养基均购自美国Gibco公司。ZEB1抗体兔单克隆抗体均购自Abcam(ab71286)。Transwell小室购自美国Millipore公司，Matrigel购自美国BD公司。H19、miR-141及对照慢病毒购自上海吉凯制药技术有限公司。Lipofectamine2000转染试剂购于日本TaKaRa公司。PCR试剂盒购自美国Sigma公司。荧光素酶活性检测试剂盒购自Promega公司。荧光素酶报告载体由Promega公司合成。

1.2方法

1.2.1qPCR实验 使用miRNA提取试剂盒进行mRNA抽提，实验过程按照试剂盒使用说明进行，抽提之后，使用核酸浓度检测仪检测RNA浓度和纯度，最后将其浓度稀释至50 μg/ml，使用特异性反转录引物进行cDNA合成，反应条件按照cDNA合成试剂盒使用说明进行设置。反应条件：95℃预变性10 min、95℃变性15 s、60℃退火32 s，循环50次后检测其溶解曲线，检测完成后，通过计算机系统自动分析各样本Ct值，然后采用2-ΔΔCt计算miRNA的相对表达量。实验重复3次。H19引物序列：5′-GTAGCGTAGCTTGAGCGTAGCGTAG-3′(正向)和5′-CGTGAGCTGAAAAGTCGATGCGATC-3′(反向)。miR-141引物序列：5′-TGCTAGCTGAGTCGAGTT-TCAGCT-3′(正向)和5′-ATGCTAGAAATGTGCAGCTAGCTA-3′(反向)。

1.2.2双荧光素酶实验 miR-141-3′UTR WT代表野生型质粒载体和质粒结合共转染到293T细胞内，miR-141-3′UTR MUT代表突变型质粒载体和质粒结合共转染到293T细胞内，同时使用pGL-3.0(荧光素酶)作为内参照，检测NC组和H19-siRNA组293T细胞中miR-141的荧光活性相对值。使用Lipofecta-mine2000(Invitrogen)检测转染效率在孢菌素酶活性的基础上正常化。根据制造商的说明书，通过双荧光素酶检测H19对miR-141的表达活性的调控能力，明确H19对miR-141荧光活性的调控情况。

1.2.3Transwell侵袭试验 所有试剂及器材均于冰块上预冷处理，将Transwell小室置于24孔板内，将Transwell小室内膜均匀涂抹Matrigel胶100 μl，37℃孵育20 min，逐步消化、离心、计数细胞后，按照2.5×104ml-1用无血清培养基将卵巢癌细胞稀释，制成细胞悬液；按照每孔200 μl的细胞悬液加入Transwell上室，同时在Transwell下室加入10%FBS+培养基500 μl，放入37℃孵箱培养；孵育24 h后使用甲醛固定细胞，结晶紫染色15 min，使用棉签去除小室内膜上的细胞，然后于显微镜下计数，观察4个高倍视野(×40)下穿过滤膜的细胞数。实验重复3次。

1.2.4划痕愈合实验 将卵巢癌细胞接种于6孔板，待细胞融合度生长到90%时，用200 μl消毒枪头垂直划线，并在显微镜下测量划痕的初始距离(0 time)，在恒温孵箱中孵育36 h和72 h后，测量划痕的距离，并计算细胞的迁移率。细胞迁移率的计算公式=[迁移距离D(0 h)-迁移距离D(36 h、72 h)]/迁移距离D(0 h)。实验重复3次。

1.2.3Western blot实验 按照说明书配置SDS-PAGE胶，每孔上样量为30 μl，进行凝胶电泳，电转至PVDF膜上。使用5%脱脂牛奶充分封闭膜，并与一抗(ZEB1浓度为1∶1 000)，内参GAPDH(浓度1∶2 000)，4℃，孵育过夜。次日，TBST充分冲洗过后，使用二抗辣根酶标记物(浓度1∶2 000)孵育2 h，TBST充分冲洗过后，化学荧光发光法(ECL)检测目标蛋白的表达情况。实验重复3次。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行数据分析(SPSS，Chicago，IL，USA)，使用χ2进行表示。t检验是用于分析组之间的差异统计。P<0.05被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1lncRNA H19和miR-141在卵巢癌组织和细胞株中的表达情况 qPCR结果表明：(图1A)与癌旁正常卵巢组织相比，卵巢癌中H19 mRNA表达水平明显较高[(2.25±0.17)vs(1.09±0.07),P<0.05]，差异有统计学意义；miR-141在卵巢癌中的表达水平相对下调[(3.07±0.07)vs(1.42±0.14),P<0.05]，差异具有统计学意义。H19 mRNA在ES-2卵巢癌细胞株中表达水平比其他卵巢癌细胞株高(图1B)。综合上述实验结果，我们挑选ES-2作为进一步生物学功能实验的细胞株。

图1 H19和miR-141 在卵巢癌组织和细胞株中的表达情况Fig.1 Expression of lncRNA H19 and miR-141 in ovarian cancer tissues and cell linesNote: A.Expression of H19 and miR-141 in ovarian cancer;B.Expression of H19 in ovarian cancer cell lines.*.P<0.05.

2.2lncRNA H19和miR-141之间的相互调控关系 本实验使用生物信息网站预测工具发现H19可能与miR-141有相似的结合位点序列(图2A)。双荧光素酶报告基因结果显示(图2B)：H19可以明显抑制miR-141的荧光素酶活性，H19-siRNA能与miR-141的3′UTR特异性结合，影响其表达水平及活性。

2.3lncRNA H19和miR-141对卵巢癌细胞迁移行为的影响 为了检测H19对卵巢癌ES-2细胞迁移能力的影响，划痕愈合实验结果显示(图3)： 和NC对照组相比，H19-siRNA组在不同时间点的细胞迁移比率明显降低[36 h(20.62±3.07)%vs(57.36±7.06)%，P<0.05;36 h(62.05±8.62)%vs(91.58±11.08)%，P<0.05]，差异有统计学意义(P<0.05)。表明抑制H19的表达后可以在一定程度上抑制卵巢癌ES-2细胞的迁移能力。

2.4lncRNA H19和miR-141对卵巢癌细胞侵袭行为的影响 为了检测H19对卵巢癌ES-2细胞侵袭能力的影响，Transwell侵袭实验结果显示(图4)： H19-siRNA组通过Matrigel基质胶的细胞数量为42.08±7.19，明显少于NC组228.00±21.95，差异有统计学意义(P<0.05)。表明抑制H19的表达后可以在一定程度上抑制卵巢癌ES-2细胞的侵袭能力。

图2 lncRNA H19 和miR-141 之间的相互调控关系Fig.2 Mutual regulation between lncRNA H19 and miR-141Note: A.H19 and miR-141 binding sites;B.Double luciferase to detect the correlation between H19 and miR-141.*.P<0.05.

图3 lncRNA H19对卵巢癌ES-2细胞株迁移能力的影响Fig.3 Effect of lncRNA H19 on migration of ovarian cancer ES-2 cell lines

图4 lncRNA H19对卵巢癌ES-2细胞株迁移能力的影响Fig.4 Effect of lncRNA H19 on migration of ovarian cancer ES-2 cell linesNote: *.P<0.05.

2.5miR-141对lncRNA H19的逆向调控作用 实验结果显示，分别转染了H19-siRNA和miR-141-inhibitor后，H19可以抑制miR-141的表达活性，miR-141可以反向调控H19的表达，同时共转染H19和miR-141的模拟物后，可以观察到H19和miR-141的表达均出现相应的下调，表明H19和miR-141之间有一定反馈调节关系(图5)。

2.6lncRNA H19和miR-141可共同调控ZEB1蛋白的表达 Western blot检测H19和miR-141对ZEB1蛋白的表达情况的影响。结果显示(图6)：在H19-siRNA组中ZEB1的表达水平比NC组的明显降低[(0.83±0.13)% vs (2.21±0.28)%，P<0.05]，而转染miR-141-inhibitor之后，ZEB1的表达水平也相应下调[(1.08±0.07)% vs (2.21±0.28)%，P<0.05]，差异具有统计学意义。表明H19和miR-141的表达和ZEB1蛋白的激活有关，间接也证明了H19和miR-141之间相互调控的反馈关系。

图5 H19和miR-141之间的相互调控关系Fig.5 Relationship between H19 and miR-141Note: *.P<0.05;**.P<0.01.

图6 Western blot检测H19和miR-141对ZEB1蛋白的影响情况Fig.6 Effect of H19 and miR-141 on ZEB1 protein detected by Western blot

3 讨论

一般来说，具有蛋白质编码能力的lncRNA通常在肿瘤组织或细胞的发育阶段以特异性方式表达，而lncRNA不编码蛋白质，其在组织和细胞的发育和疾病中起到调控和监视作用，且lncRNA分子可以成为临床治疗中的有效的生物靶点[12,13]。最近越来越多的研究表明，lncRNA可以与mRNA的MREs竞争，从而影响基因靶标表达[14]。然而，lncRNA和miRNA在恶性卵巢肿瘤发生发展过程中的具体作用目前了解甚少，深度探讨lncRNA和miRNA之间的相互作用将有助于研究基于miRNA/lncRNA对卵巢癌的诊断和治疗。

在本研究中，首先证实H19在卵巢癌中表达上调，miR-141在卵巢癌组织中表达下调，而通过生物信息学验证H19可以直接调控miR-141的表达活性。此外，本实验还通过细胞生物学实验表明抑制H19的表达后可以有效抑制卵巢癌的迁移和侵袭能力。这和Zhou等[15]在胃癌细胞中的研究结果一致，miR-141在几种人类恶性肿瘤中存在表达失调情况，尤其在肝癌中miR-141和miR-29c可以通过直接作用于ITGB1肿瘤抑制因子参与胃癌细胞增殖和侵袭的调控过程。miR-141表达失调是胃癌发生过程中早期就存在的表现，可用于胃癌患者的早期诊断和治疗的生物标志物[16]。之前有研究表明，miR-141可以通过靶向调控转录激活因子4(STAT4)及相关信号通路抑制卵巢癌细胞增殖，同时干扰卵巢癌细胞的细胞周期，影响其凋亡[16]。 Mei等[17]研究表明，miR-141表达水平在非小细胞肺癌组织中也明显上调，其可以调控PHLPP1和PHLPP2表达上调诱导体外非小细胞肺癌细胞的增殖和体内肿瘤的生长。这可能与miR-141的肿瘤特异性相关，在部分肿瘤组织类型中可能是起到致癌作用，但在另一种肿瘤组织类型中可能起到抑制肿瘤的作用，这取决于肿瘤的类型和不同性质的肿瘤细胞。

lncRNA H19具有相对保守的开放阅读框架，不参与RNA分子的转录和翻译过程，但是具有稳定的二级RNA结构，一般在胚胎和胎盘组织中存在水平较高，并且可能在胚胎发生和胎儿生长中起关键作用[18,19]。最新研究证据表明，lncRNA H19在许多类型的恶性肿瘤中均存在表达异常情况，包括肝细胞癌、卵巢癌、结肠癌和乳腺癌中存在过表达情况，但H19参与卵巢癌的潜在作用机制尚不清楚[20-23]。Zhu等[24]也提出，lncRNA H19及其衍生物可以调控miR-675的表达活性与神经胶质瘤的临床转移比例呈正相关关系，H19可以通过衍生物诱导miR-675的表达进而调节胶质瘤细胞的侵袭。在本研究中，通过调查H19和miR-141在卵巢癌中的表达和作用，明确H19对卵巢癌ES-2细胞的促癌作用，抑制H19表达后ES-2细胞迁移和侵袭特性明显降低，而miR-141可以反向调控H19的表达活性，共同参与卵巢癌细胞的生物学行为的调控。此外，我们还检测了H19对miR-141及其靶基因ZEB1水平的作用。结果显示H19可与miR-141竞争调控ZEB1蛋白的表达，共同影响下游ZEB1的活性，然而本实验仅仅研究了一种miRNA和lncRNA H19之间的关系，H19是否和其他miRNA有直接或间接的调控关系，是否共同影响卵巢癌的生物学活动，后续实验将进行更深入的研究。

综上所述，本研究显示在卵巢癌中lncRNA H19与miR-141之间的相互调控关系，表明H19的异常表达与ZEB1蛋白的激活有密切关系，共同调控卵巢癌的发生发展过程和卵巢癌细胞的迁移转移行为。其有可能成为预测卵巢癌的进展、预后和监测治疗效果的分子标志物。因此，更多的lncRNAs的鉴定将增强对lncRNAs在恶性肿瘤中功能的了解，能够更好地了解卵巢癌的发病机理，促进对其早期诊断和治疗方向的发展。