重楼皂苷Ⅰ抑制肺腺癌A549细胞侵袭转移作用机制研究①

牟海军 赵 丹 石寒冰 毕红霞 姜云飞 刘国华

(齐齐哈尔医学院附属第三医院呼吸科，齐齐哈尔161000)

肺癌发病率及死亡率均居恶性肿瘤第一位，且早期发生转移[1]，而中医药在抗肿瘤方面具有重要的作用。中医药抗肿瘤的基本原则是益气养阴扶助正气、清热解毒祛除邪气。因此本课题应用清热解毒作用较强的重楼有效成分重楼皂苷Ⅰ，通过体外细胞实验，观察其对肺腺癌A549细胞侵袭转移及相关因子的影响，明确其抑制肿瘤侵袭转移的作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验材料、试剂 F12K培养基(Sigma)；胎牛血清(Hyclone)；CCK8试剂(碧云天)；肺腺癌A549细胞(齐齐哈尔医学院岳丽玲主任惠赠)； 重楼皂苷Ⅰ(上海高创化学科技有限公司)；Transwell小室(Corning)；Western blot蛋白提取及浓度测定试剂(碧云天)； MMP-2、E-cad、GAPDH(Proteintech)；二抗(CST)；RNA提取试剂(TIANGEN)；Perfect real time-PCR试剂盒(TAKABA)；PCR引物设计及合成(上海生工)；CO2培养箱(Thermo Forma)；BX60F-3荧光照相显微镜(Olympus)；5082型酶联免疫检测仪(TECAN)； Bio-Rad Model 785型电转移仪； ChemiDocMP 全自动荧光和化学发光成像分析系统(伯乐公司)；7300荧光定量PCR仪(ABI)。

1.2方法

1.2.1应用CCK8法检测重楼皂苷Ⅰ对人肺腺癌 A549 细胞增殖的影响 取对数生长期的肺腺癌A549细胞，经消化、离心、重悬后制成单细胞悬液(密度为0.5×105个/ml)，按照每孔200 μl接种在96孔板中，接着将96孔板放入CO2培养箱中，培养24 h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的重楼皂苷Ⅰ。重楼皂苷Ⅰ的浓度分别为：0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/L。实验另设空白对照组，每组6个复孔。加药48 h后每孔加入CCK溶液10 μl，放入CO2培养箱中继续培养2 h，最后用酶标仪检测各孔的吸光度值并记录实验结果，计算各组的增殖抑制率。抑制率=(1-实验组OD值/空白对照组OD 值)×100%。实验共重复3次。

1.2.2Transwell及细胞划痕实验检测重楼皂苷Ⅰ对人肺腺癌 A549 细胞侵袭转移的影响。

1.2.2.1Transwell实验 取对数生长期的肺腺癌A549细胞，经消化、离心、重悬后制成单细胞悬液(密度为0.5×106个/ml)，按照每孔2.5 ml接种在6孔板中，接着将6孔板放入CO2培养箱中，培养24 h，待细胞完全贴壁后，加入不同浓度的重楼皂苷Ⅰ。根据前面重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞增殖实验的结果，选择重楼皂苷Ⅰ浓度为0.5 mg/L(B组)、1 mg/L(C组)、2 mg/L(D组)、4 mg/L(E组)进行药物干预，实验另设空白对照组(A组)。于加药24 h后消化、离心、重悬细胞，取150 μl接种于Transwell上室中，下室加30%血清培养基500 μl，放入CO2培养箱中继续培养24 h，然后弃掉培养基，用甲醇固定20 min，再用结晶紫染色20 min，最后用自来流水冲洗，待晾干后应用显微镜观察穿过的细胞数量。显微镜下随机选5个视野计算穿过细胞数的平均值并计算抑制率。抑制率=(1-加药组细胞数/对照组细胞数)×100%。实验共重复3次。

1.2.2.2细胞划痕实验 取对数生长期的肺腺癌A549细胞，经消化、离心、重悬后制成单细胞悬液(密度为0.5×106个/ml)，按照每孔2.5 ml种在6孔板中(板底外侧用记号笔标记3条间隔0.5 cm水平直线)，接着将6孔板放入CO2培养箱中，培养24 h，待细胞完全贴壁后，用10 μl移液器的枪头尖，沿事先标记的水平直线做垂直划痕，划完后用PBS冲掉不贴壁的细胞，然后加入不同浓度的重楼皂苷Ⅰ。重楼皂苷Ⅰ浓度选择及实验分组同Transwell实验。于划痕后即刻(0 h)、48 h拍照观察各孔细胞划痕状态。用Image J图像软件测量划痕宽度，计算划痕愈合距离及抑制率。划痕愈合距离=0 h划痕宽度-48 h划痕宽度；抑制率=(1-加药组划痕愈合距离/对照组划痕愈合距离)×100%。实验共重复3次。

1.2.3应用Western blot、Qrt-PCR检测重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞MMP2、E-cad蛋白及mRNA表达的影响。

1.2.3.1Western blot实验 前期细胞培养、实验分组及给药剂量同Transwell实验及细胞划痕实验。于加药48 h后将细胞刮下来，收集、离心，然后按照每管加入300 μl细胞裂解液，冰上放置30 min后，4℃ 15 000 r/min离心5 min后吸取上清即为蛋白样品，并采用BCA法测定各样本蛋白浓度。首先将配好的积层胶加入电泳仪中，再加样，进行电泳，开始0.5 h为70 V，后改为110 V，约1.5 h后上电转机进行转膜，75 V 2 h转膜完毕后用封闭液4℃过夜。第二日从封闭液中取出PVDF膜，然后根据各蛋白分子量裁剪膜大小，加入配好的抗体，室温孵育2 h，5%TBST洗膜，放在摇床上5 min洗3次，再加入二抗，1.5 h后加入发光剂，放在全自动荧光和化学发光成像分析系统，应用Image Lab软件分析各条带灰度，以MMP2、E-cad蛋白与GAPDH内参的比值表示MMP2、E-cad的水平。

1.2.3.2Qrt-PCR实验 前期细胞培养、实验分组及给药剂量同Transwell实验及细胞划痕实验。于加药48 h后用RNA提取试剂盒提取总RNA，用Perfect real time-PCR试剂盒逆转录形成cDNA后行Qrt-PCR。PCR反应条件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 10 s，60℃ 60 s，共40个循环。引物序列：MMP2上游5′-GCCCAAGAATAGATGCTGACTG-3′，下游5′-TGAAAGGAGAAGAGCCTGAAGTG-3′；E-cad上游5′-TTCTGGAAGGAATGGAGGAGTC-3′，下游5′-ACCTGGAATTGGGCAAATGTG-3′；GAPDH上游5′-GGTCTCCTCTGACTTCAACA-3′，下游5′-AGCCAATTCGTTGTCATAC-3′。以MMP2、E-cad mRNA和GAPDH的比值表示MMP2、E-cad水平。

2 结果

2.1重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞增殖的影响 结果见图1，浓度为0.25、0.5、1、2、4、8、16 mg/L的重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞的抑制率分别为(2.10±1.2)%、(11.98±2.4)%、(24.32±3.5)%、(38.76±4.3)%、(49.25±4.9)%、(62.55±5.3)%、(83.85±6.4)%，各抑制率比较差异有统计学意义(P<0.05)。并且随着重楼皂苷Ⅰ剂量的增加抑制率升高，抑制率与剂量呈正相关，具有量效关系。重楼皂苷Ⅰ对人肺腺癌A549细胞的IC50为3.64 mg/L。

2.2重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞侵袭转移的影响 从表1和图2、3可以看出重楼皂苷Ⅰ与空白对照组比较，划痕愈合距离缩短，穿过的细胞数量减少，具有抑制细胞侵袭转移能力，随着剂量的增加，抑制作用增强，各组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞MMP2、E-cad表达的影响 从表2和图4可以看出重楼皂苷Ⅰ与空白对照组比较，MMP2表达降低，E-cad表达升高，随着剂量的增加，变化幅度增大，各组比较差异有统计学意义(P<0.05)，说明重楼皂苷Ⅰ可以下调MMP2表达，上调E-cad表达，并且呈量效依赖关系。

图1 重楼皂苷Ⅰ抑制肺腺癌A549细胞增殖量效曲线Fig.1 Inhibitory effect and concentrations of polyphyllins Ⅰ on proliferation of lung adenocarcinoma A549 line cells

GroupsCell scratchScratch healing distance(μm)Inhibition Ratio(%)Transwell cells testCells countInhibition ratio(%)A240.7±11.7 -250±16 -B177.8±10.31)26.13±2.8186±101)25.32±3.1C158.8±9.41)2)34.01±3.22)166±91)2)33.45±3.42)D141.4±8.51)2)3)41.22±3.92)3)147±101)2)3)43.01±4.22)3)E123.8±8.11)2)3)4)48.54±4.52)3)4)127±91)2)3)4)51.44±4.82)3)4)F 64.95 20.71 59.42 25.01P <0.05 <0.05 <0.05 <0.05

Note：A.Control group;B.0.5 mg/L polyphyllin Ⅰ;C.1 mg/L polyphyllin Ⅰ;D.2 mg/L polyphyllin Ⅰ;E.4 mg/L polyphyllin Ⅰ.1)Compare with A,P<0.05；2)Compare with B,P<0.05；3)Compare with C,P<0.05；4)Compare with D,P<0.05.

GroupsWestern blotMMP2/GAPDHE-cad/GAPDHQrt-PCRMMP2/GAPDHE-cad/GAPDHA 1.08±0.0620.39±0.0350.95±0.0610.35±0.031B 0.87±0.0581)0.56±0.0471)0.82±0.0591)0.44±0.0491)C 0.65±0.0651)2)0.95±0.0621)2)0.65±0.0641)2)0.64±0.0631)2)D 0.45±0.0461)3)1.15±0.0781)2)3)0.48±0.0621)2)3)0.84±0.0551)2)3)E 0.31±0.0391)2)3)4)1.47±0.0971)2)3)4)0.34±0.0471)2)3)4)0.97±0.0581)2)3)4)F96.17126.0752.7174.53P<0.05<0.05<0.05<0.05

Note：A.Control group;B.0.5 mg/L polyphyllin Ⅰ;C.1 mg/L polyphllin Ⅰ;D.2 mg/L polyphyllin Ⅰ;E.4 mg/L polyphyllin Ⅰ.1)Compare with A,P<0.05；2)Compare with B,P<0.05；3)Compare with C,P<0.05；4)Compare with D,P<0.05.

图2 重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞侵袭转移的影响(Transwell实验,×40)Fig.2 Effects of polypyhllin Ⅰ on invasion and metastasis of A549 cells(Transwell test,×40)

图3 重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞侵袭转移的影响(细胞划痕实验,×40)Fig.3 Effects of polyphyllin Ⅰ on invasion and metastasis of A549 cells(Cell scratch test,×40)

图4 重楼皂苷Ⅰ对人肺腺癌A549细胞MMP2、E-cad蛋白表达的影响(Western blot)Fig.4 Effects of polypyhllin Ⅰ on MMP2，E-cad protein of A549 cells(Western blot)

3 讨论

肺癌分为小细胞肺癌与非小细胞肺癌。腺癌属于非小细胞肺癌，是目前肺癌组织分型中最常见的病理类型，约占全部肺癌的40%～50%，肺腺癌大多数位于肺的外周[2,3]，早期不会侵犯到气管及支气管而引起咳嗽、咳痰、咯血等呼吸道症状，容易被忽视，当出现症状时，病程多已进展为中晚期肺癌。并且肺腺癌早期易侵犯血管及淋巴管，故容易出现远处转移，金晶等[4]研究报道肺腺癌转移占转移瘤52.0%。因此很多患者失去手术根治的机会，预后较差。治疗手段只能以化疗为基础，包括放疗、靶向治疗、免疫治疗、中医药治疗等综合治疗。

中药是祖国医学的瑰宝，具有多靶点、多途经、作用持久、不良反应少等优点，在抗肿瘤方面逐渐被重视，越来越多的中药被发现具有抗肿瘤作用[5]，并且很多的西药，如化疗药物直接来源于天然中药。中医抗肿瘤的方法包括：清热解毒、软坚散结、活血化瘀、扶正固本、益气养阴、健脾益肾等。重楼，又名七叶一枝花，是一味药性较强的清热解毒药。重楼的化学成分包括甾体皂苷、游离氨基酸、多糖等，其中甾体皂苷主要为重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ等，约占总化合物的80%[6,7]。现代药理研究发现重楼在抗肿瘤方面具有较好的活性。中药抗肿瘤的机制包括：①抑制肿瘤细胞增殖；②影响肿瘤细胞周期；③诱导肿瘤细胞凋亡；④诱导肿瘤细胞自噬；⑤抑制肿瘤新生血管生成；⑥增强机体免疫力。重楼皂苷Ⅰ为重楼的主要有效成分，一些研究表明重楼皂苷Ⅰ具有抗肿瘤作用，主要表现为抑制肿瘤细胞的增殖，阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡等。姜福琼等[8]研究发现重楼皂苷Ⅰ能够将膀胱癌细胞周期阻滞于G2/M 期;使Bcl-2、Caspase-9减少，Cyt C和Caspase-3增加，影响凋亡相关蛋白的表达而发挥抗膀胱癌作用。罗吉等[9]研究发现重楼皂苷Ⅰ可抑制结肠癌HCT116 细胞增殖及通过线粒体途径诱导细胞凋亡，机制可能与其降低Bcl-2 的表达，升高 Bax 的表达有关。陈舒怡等[10]研究发现重楼皂苷Ⅰ能抑制肺癌NCI-H661细胞增殖，并且能诱导细胞产生凋亡，呈剂量依赖性，并且能使 Caspase-8、Caspase-9、Bcl-2表达减少，分析重楼皂苷Ⅰ可能通过线粒体碎裂诱导NCI-H661凋亡。

关于重楼皂苷Ⅰ是否具有抗肿瘤转移及机制的研究较少，基于此本课题组成员前期通过动物实验观察重楼皂苷Ⅰ对接种肺腺癌 A549 细胞免疫缺陷 BALB/c裸鼠的抑瘤率、镜下改变等，发现重楼皂苷Ⅰ具有抑制肺癌组织生长及抗肺癌转移的作用[11]。本课题又采用Transwell及细胞划痕实验观察重楼皂苷Ⅰ对人肺腺癌 A549 细胞侵袭转移的影响，发现重楼皂苷Ⅰ能够使划痕愈合距离缩短，穿过Transwell细胞数量减少，具有抑制细胞侵袭转移能力，随着剂量的增加，作用增强，此结论进一步从体外细胞实验验证了重楼皂苷Ⅰ的抗肺癌转移作用。

目前研究认为肺癌的侵袭转移与MMPs家族及E-cad相关。MMP2作为MMPs的重要组成在肿瘤组织及细胞侵袭转移中发挥着重要作用。众多的研究发现非小细胞肺癌组织中的MMP2明显高于癌旁正常组织，且与淋巴结转移和临床分期呈正相关[12-14]。E-cad与肿瘤细胞的黏附功能有关。当肿瘤组织中的E-cad表达下调，其介导的细胞黏附力减弱后肿瘤组织及细胞浸润性和游走迁移能力增强，因此肿瘤细胞容易发生浸润和远处转移。熊海林等[15]发现E-cad 在非小细胞肺癌、脑转移中存在低表达。郭晓峰等[16]研究发现E-cad在非小细胞肺癌组织的表达与肿瘤分化程度、临床病理TNM分期和淋巴结转移显著相关，提示其可能在非小细胞肺癌的发展、浸润、转移中起一定的作用，并能够预测预后。因此本课题通过Western blot、Qrt-PCR检测重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞MMP2、E-cad表达的影响，结果发现MMP2表达降低，E-cad表达升高，随着剂量的增加，变化幅度增大，表明重楼皂苷Ⅰ可能通过下调MMP2表达，上调E-cad表达，来达到抑制肺癌侵袭转移的能力。本课题组成员还将重楼皂苷Ⅰ与化疗药物联合作用于肺腺癌A549细胞，发现两者在抑制肺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡、侵袭转移等方面具有增效作用[17]。

综上所述，重楼皂苷Ⅰ具有抑制肿瘤细胞增殖及侵袭转移作用，其机制可能是通过下调MMP2表达，上调E-cad表达。这是一个具有广泛前景的抗肿瘤药物，值得研究和开发，但中药作用途径广泛，靶点比较多，本课题主要研究的是重楼皂苷Ⅰ对肺腺癌A549细胞MMP2、E-cad两个因子表达的影响，有没有其他的途径及靶点，这将是我们下一步的研究方向。