HPLC-MS/MS法同时检测抗风湿中药制剂中非法添加9种糖皮质激素的方法建立

2018-10-12言慧洁潘源虎

中国合理用药探索 2018年10期

言慧洁，潘源虎

（1.湖北省直属机关医院，湖北武汉 430071；2．华中农业大学动物科技与动物医学院，湖北武汉430072）

糖皮质激素（glucocorticoid，GCS）属于类固醇激素，是由肾上腺皮质束状带分泌的一类甾体激素，临床上常用于风湿性及类风湿性关节炎、皮炎和某些感染类疾病的综合治疗，疗效较好，但使用不当会产生不良反应，需在医师指导下使用[1-6]。中药制剂在治疗和缓解类风湿关节炎等自身免疫性疾病方面具有独特的效果，诸如白芍总苷[7]、雷公藤多苷[8]等一批疗效确切的中药制剂已被广泛应用于临床。一些不法商家为突显产品疗效，牟取暴利，在抗风湿类中药制剂和保健品中非法添加GCS类药物[9-10]，长期用药会对患者造成潜在的健康和生命威胁。GCS类药物的检测方法主要有高效液相色谱法[11-14]、毛细管色谱法[15-16]、薄层色谱法[17]、气相色谱－质谱联用法[18]、液相色谱－质谱联用法[19-21]等。本文建立了一种方法快捷、准确、专属性强的高效液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS/MS），用于检测抗风湿类中药制剂中非法添加的9种GCS类化学药品。

1 仪器和试药

1.1 仪器

API5000高效液相色谱-串联四极杆质谱仪（美国AB/SCIEX公司）。

1.2 试剂与试药

对照品：醋酸泼尼松（prednisone acetate 100012-201407）、醋酸泼尼松龙（prednisolone acetate 100124-201104）、醋酸可的松（cortisone acetate 100123-201204）、醋酸氢化可的松（hydrocortisone acetate 100013-201408）、醋酸甲基泼尼松（meprednisone acetate 100828-201405）、醋酸地塞米松（dexamethasone acetate 100129-201504）、醋酸倍他米松（betamethasone acetate 100118-201204）、丙酸倍氯米松（beclomethasone dipropionate 100119-201504）；醋酸氟氢可的松（fiudrocortisones acetate 100009-201104），含量＞98%，购自中国食品药品检定研究院。所用试剂均为色谱纯，分析用水经18.2 MΩ/cm处理。阴性样品用抗风湿中药制剂复方风湿宁胶囊（广东罗浮山国药股份有限公司，国药准字：Z20060214，L16A091）。

2 方法与结果

2.1 实验条件

2.1.1 液相色谱条件色谱柱：Venusil MP C18（2），2.1×150 mm，5 μm；流动相A为0.1%甲酸-水，B为乙腈；柱温40℃，流速0.2 mL/min，进样量5 μL，梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序

2.1.2 质谱条件电喷雾离子源（ESI），喷雾电压3.0 kV，离子源温度110℃，采用正离子（ESI+）扫描模式和多重反应监测（MRM）模式。GCS类药物选择反应监测的优化参数见表2。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液分别精密称取9种对照品约10 mg，置10 mL容量瓶中，分别用乙腈溶解后定容至刻度，做为对照品储备液（1 mg/mL），置于-20℃冰箱中，待检。再精密量取各对照品溶液适量，配制成含醋酸泼尼松、醋酸可的松、醋酸氢化可的松各2 μg/mL，醋酸地塞米松、醋酸倍他米松、醋酸泼尼松龙、醋酸甲基泼尼松、醋酸氟氢可的松各1 μg/mL、丙酸倍氯米松0.5 μg/mL的高质量浓度对照品混合溶液；精密量取该高质量浓度对照品混合溶液5.0 mL，置于25 mL量瓶中，用初始流动相稀释至刻度，摇匀，得较低质量浓度的混合对照品溶液。

2.2.2 样品溶液取适量复方风湿宁胶囊内容物，研细，称取0.5 g（准确至0.1 mg），置于100 mL量瓶中，加入乙腈80 mL，超声提取30 min，放冷至室温，加乙腈定容至刻度，摇匀后过滤，取续滤液过0.22 μm滤膜，即为阴性样品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 专属性取“2.2”项下低浓度混合对照品溶液和阴性样品溶液各5 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，记录图谱。9种GCS类药物的混合对照品溶液提取离子流图见图1，各目标化合物的保留时间见表2。

2.3.2 线性范围和检测限分别精密量取“2.2.1”项下高质量浓度对照品混合溶液0.2，0.5，1，2，4，6，10 mL于25 mL的量瓶中，用初始流动相稀释至刻度，摇匀，配制成一系列质量浓度的对照品混合溶液，分别过0.22 μm的滤膜。精密量取5 μL进样，记录图谱，将峰面积（A）与其相对应的组分质量浓度（C）进行线性回归。按信噪比（S/N）为3时计算9种GCS类非法添加物的检测限；按S/N为10时计算9种GCS类非法添加物的定量限。见表3。

表2 9种GCS的保留时间及质谱采集参数

图1 9种GCS类药物提取离子色谱图

2.3.3 精密度试验精密量取“2.2.1”项下低质量浓度混合对照品溶液5 μL，按上述实验条件进样，连续重复6次，记录图谱，按峰面积计算RSD，各成分的RSD（n=6）分别为：醋酸泼尼松0.61%、醋酸可的松0.75%、醋酸泼尼松龙0.56%、醋酸氢化可的松0.49%、醋酸甲基泼尼松1.29%、醋酸地塞米松0.68%、醋酸倍他米松0.59%、醋酸倍氯米松1.12%、醋酸氟氢可的松0.95%。

2.3.4 加样回收率精密称取3份阴性样品各0.5 g，分别加入“2.2.1”项下高质量浓度对照品混合溶液1，5，10 mL，按“2.2.2”项下方法制备成含有9种GCS药物低、中、高3个质量浓度水平的溶液，每个浓度平行6次。按实验条件进样5 μL，记录图谱，测定各样品中药物含量，计算加样回收率，结果见表4，9种GCS类药物在低、中、高3个浓度水平上测得的平均回收率为89.5%～112.6%，RSD＜8.3%。

表3 9种GCS类药物的线性关系、相关系数、检测限（LOD）和定量限（LOQ）

表4 9种GCS类药物的加样回收率

2.3.5 样品稳定性试验取“2.3.4”项下添加高质量浓度水平的溶液，分别在0，6，12，24，48 h时取样，按实验条件连续进样6次，记录图谱。结果9种GCS类药物的峰面积测定值的RSD均＜5.8%。表明供试品溶液在48 h内稳定。

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

由于中药成分复杂，在GCS类非法添加物剂量不确定的情况下，基质干扰大，容易出现假阳性或假阴性结果，给检测工作带来难度。本文通过比较阴性样品溶液和对照品溶液的液质图谱，未发现干扰9种GCS类药物的色谱峰，表明建立的方法专属性良好。本实验采用MRM模式提高了检测灵敏度，但是由于醋酸地塞米松和醋酸倍他米松是同分异构体，仅仅在16位的-CH3的构型不同（地塞米松是α构型，倍他米松是β构型），它们在质谱中分离出的母离子和碎片子离子完全相同。本实验经反复试验，选择使用乙腈、0.1%甲酸-水梯度洗脱，以提高醋酸地塞米松和醋酸倍他米松的色谱分离度，满足定量需要。有文献报道当流动相中甲酸含量为0.05%～0.1%时，随着甲酸含量的增加，GCS的响应值逐渐增加，并且醋酸地塞米松和醋酸倍他米松的分离效果良好。同时流动相中加入甲酸能增强被测物质的电离效果，且能改善色谱峰拖尾现象[22]。

3.2 9种GCS类药物的质谱行为

质谱参数优化结果表明，在ESI模式下，GCS的质谱响应灵敏度较高。质谱断裂方式有如下规律：含有氟的化合物在二级质谱分析时，产生丰度较高的[M-HF]+离子（M-20），如醋酸地塞米松、醋酸倍他米松、醋酸氟氢可的松；醋酸酯的GCS类药物，在二级质谱碎片中，还容易产生脱[M-CH3COOH]+的特征碎片离子（M-60），如本研究中的醋酸泼尼松、醋酸泼尼松龙和醋酸可的松。由于此类甾体激素结构中含有羟基，在进行二级质谱分析时，均能产生脱水的碎片离子。这些特征碎片离子可以作为其特征的例子对样品中此类甾体激素进行定性分析，也可以选择作为定量的离子。