消炎利胆胶囊的HPLC指纹图谱研究

张继红，毛坤军，周兴卓，金贤武，黄平

（1.上饶市食品药品检验检测中心，江西 上饶 334000；2.江西医学高等专科学校药学系，江西 上饶334000；3.青岛大学附属医院，山东 青岛 266000）

消炎利胆胶囊是由溪黄草、穿心莲、苦木3味中药组成的中药复方制剂，属国家中药保护品种；具有清热、利胆、祛湿的功效[1]；主要用于口苦、胁痛、急性胆囊炎、胆管炎等疾病的治疗[2]。目前，消炎利胆胶囊的质量控制方法为国家食品药品监督管理局标准WS3-135（Z-135）-2002Z-2011，标准中以穿心莲、溪黄草、苦木3味组成药为对照药材进行薄层色谱鉴别，以穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯为主要指标进行含量测定[3]。文献报道，消炎利胆胶囊质量分析主要涉及穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯及绿原酸、迷迭香酸的含量测定[4-6]。此中药复方制剂指纹图谱的研究还未见报道，无法全面反映该药的整体质量。《中华人民共和国药典》（2010年版）编制大纲中提出中成药质量标准应“逐步由单一指标性成分定性定量测定，向活性、有效成分及生物测定的综合检测过渡，向多成分和指纹或特征图谱整体质量控制模式转化”的指导思想[7]，故本实验采用高效液相色谱法（HPLC）研究不同厂家生产的13批消炎利胆胶囊的指纹图谱，建立了分离度、重现性均较好的HPLC，为建立消炎利胆胶囊全面、整体的质量控制方法提供科学依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪（美国Waters公司）：包括waters e2489检测器，Empower3工作站；CPA225D型电子天平（德国赛多利斯）；KQ-500DE型超声波清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；纯水仪（易普易达科技有限公司）；《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》软件2012版（国家药典委员会）。

1.2 试药

对照品：绿原酸（批号：1100753-201415）、迷迭香酸（批号：111871-201502）、咖啡酸（批号：110885-200102）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均≥98%；穿心莲对照药材（121082-201502）、溪黄草对照药材（121488-201102）、苦木对照药材（121017-201305）购自中国食品药品检定研究院；消炎利胆胶囊（S1-S8为哈尔滨一洲制药有限公司产品，批号分别为：131003，150202，141007，151112，140805，141004，150904，141205；S9-S13为贵州景诚制药有限公司产品，批号分别为20170123，20161202，20151103，2016114，20170112）；色谱级甲醇购自Merck公司；磷酸、分析甲醇为北京化工产品；水为去离子水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Gemini-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：乙腈，流动相B：0.1%磷酸水溶液；流速1.0 mL/min；柱温30℃；检测波长为330 nm；进样量10 μL。采用如下梯度洗脱程序：0～20 min，6%～20%（A）；20～45 min，20%～26%（A）；45～60 min，26%～60%（A）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备精密称取绿原酸、咖啡酸、迷迭香酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为62.1，78.3，49.8 μg/mL 的混合对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液的制备消炎利胆胶囊10粒，将内容物研细、混匀，称量约1.0 g，置100 mL量瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密称定，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，冷却，称重，用70%甲醇补足失重，摇匀，即得。

2.2.3 消炎利胆胶囊组成药提取物溶液的制备取穿心莲、溪黄草、苦木对照药材粉末各500 mg，分别置于100 mL的量瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密称定，超声处理30 min，取出，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的质量，制成质量浓度约为10 mg/mL的供试品溶液，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验取批号为150904的消炎利胆胶囊，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测。连续进样6次，记录色谱图。以绿原酸为参照峰，其保留时间和峰面积为1，计算出23个共有色谱峰的相对保留时间的RSD值＜2.0%，相对峰面积的RSD值＜3.0%，表明仪器的精密度良好。

2.3.2 重复性试验取批号150904的消炎利胆胶囊，平行6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行检测，记录色谱图。以绿原酸为参照峰，其保留时间和峰面积为1，计算出23个共有色谱峰的相对保留时间的RSD值＜2.0%，相对峰面积的RSD值＜3.0%，表明本方法的重复性良好。

2.3.3 稳定性试验取批号150904的消炎利胆胶囊，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别在0，2，4，8、12，24 h检测，记录色谱图。以绿原酸为参照峰，其保留时间和峰面积为1，计算出23个共有色谱峰的相对保留时间的RSD值＜2.0%，相对峰面积的RSD值＜3.0%，表明本方法的稳定性良好。

2.4 HPLC指纹图谱的生成及共有峰的归属和指认

2.4.1 HPLC指纹图谱的生成取13批各样品适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件检测，采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）分析l3批样品的HPLC图谱。结果显示共有特征峰23个，其中6号色谱峰的峰形好、分离度高、含量高，选择作为参照峰。见图1。

图1 13批消炎利胆胶囊指纹图谱

2.4.2 共有峰的指认和归属取混合对照品溶液、供试品溶液及各组成药提取物的供试品溶液，采用HPLC分析，结果：样品HPLC图谱23个共有峰中1，2，3，4，5，7，8，9，10，16，17，20 号来源于苦木；4，6，7，9，10，12，13，14，18，19，20，21，23 来源于穿心莲；5，8，9，11，12，14，15，16，17，20，22 来源于溪黄草；共有峰中6，8，22分别指认为绿原酸、咖啡酸和迷迭香酸。见图2。

2.4.3 相似度与各共有峰相关数据分析采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对13批样品的HPLC图谱进行比较分析。结果，13批样品的HPLC图谱相似度均＞0.90。见表1。

表1 13批利胆消炎胶囊指纹图谱相似度数据

图2 混合对照品溶液、供试品溶液及各组成药提取物的HPLC图

2.4.4 聚类和统计分析将13批消炎利胆胶囊中的23个特征峰的峰面积数据进行聚类分析和统计分析。从聚类方面看，S1-S8和S9-S13分类明显，其中S1-S8来自哈尔滨一洲制药有限公司，S9-S13来自贵州景诚制药有限公司，这可能与厂家的生产工艺和原料来源不同有关。另外，哈尔滨一洲制药有限公司的消炎利胆胶囊（S1-S8）离散程度比较大，贵州景诚制药有限公司的消炎利胆胶囊（S9-S13）离散程度比较小，可见贵州景诚制药有限公司生产的药品稳定性更好。见图3。

图3 13批消炎利胆胶囊23个特征峰OPLS-DA图和OPLS-DA3D图

3 讨论

3.1 流动相的选择

研究表明，穿心莲、溪黄草中主要含有酸性成分[8-9]，苦木中主要含有生物碱类成分[10]。为尽可能多地反映出各药物所含成分的信息，实验比较分析了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水（分别为体积分数0.1%甲酸和0.1%磷酸），乙腈-碱水（体积分数为0.02%氨水）不同梯度下的色谱图，最终发现以乙腈-0.1%磷酸水作为流动相时，所得图谱基线平、分离度好、峰型好。

3.2 提取条件的选择

试验考察提取溶剂，结果发现甲醇效果优于乙醇，因此选择甲醇作为提取溶剂；分别考察不同浓度（50%，70%，100%）和不同用量（25，50，100倍）的甲醇来提取，结果发现50倍量溶剂70%甲醇提取效率最高；考察提取方法（超声和回流）、提取时间(15，30，45，60 min)的选择，结果发现超声处理30 min效率最高，故本试验最终以50倍量的70%甲醇超声提取30 min作为供试品制备方法。

3.3 参照峰的选择

通过标准品比对指认出6号峰为绿原酸，药理活性研究表明，绿原酸具有明显的抗氧化、抗菌、抗病毒以及免疫调节等作用[11-12]，常作为中药及其制剂含量测定的指标性成分[13]，本试验图谱中绿原酸保留时间稳定，峰面积大小适中，且与前后色谱峰分离度较好，故选为参照峰。

本试验通过《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版）对13批样品的HPLC图谱进行分析，得出指纹图谱与对照图谱的相似度均＞0.90，表明采用指纹图谱对消炎利胆胶囊进行质量控制，操作简单、稳定可靠、专属性强、重复性好，并能辅助含量测定，为消炎利胆胶囊的鉴别和质量评价提供全方位的参考。