血清乙型肝炎病毒-DNA载量对乙型肝炎患者肝功能及外周血内质网应激相关指标的影响研究

刘芳，闫宇，李雅楠，戴亮，肖永红*

乙型肝炎病毒（HBV）感染是我国最严峻的公共卫生问题之一。我国目前约有HBV感染者7 000多万，乙型肝炎（以下简称乙肝）患者2 000万～3 000万［1］，若不给予有效的治疗，25%～40%的慢性乙肝患者会进展为肝硬化或原发性肝癌甚至死亡［2］。而HBV-DNA载量是预测HBV感染最直接且特异度、灵敏度高的指标；肝功能指标可以在一定程度上反映肝脏的损伤程度；且有研究表明，HBV感染可诱导肝细胞发生内质网应激（ERS）［3］。为此，本研究选取唐山市传染病医院乙肝患者及非HBV感染患者，比较不同血清HBVDNA载量乙肝患者的肝功能及外周血ERS相关指标变化，分析血清HBV-DNA载量对肝功能及ERS的影响，为乙肝的临床诊治提供依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象 选取2016年7月—2017年6月在唐山市传染病医院治疗的乙肝患者136例。其中男71例，女65例，男女比例为1∶0.9；年龄18～70岁，平均（39.8±11.9）岁。按血清HBV-DNA载量将患者分为阴性组（血清HBV-DNA载量＜1.0×103copies/ml）、低拷贝组（1.0×103copies/ml≤血清HBV-DNA载量＜1.0×105copies/ml）、中拷贝组（1.0×105copies/ml≤血清HBV-DNA载量＜1.0×107copies/ml）、高拷贝组（血清HBV-DNA载量≥1.0×107copies/ml）［4］。纳入标准：符合《慢性乙型肝炎防治指南（2015年更新版）》［5］中的诊断标准。排除标准：（1）合并甲、丙、丁、戊、庚型肝炎病毒感染者；（2）合并脂肪肝、代谢性肝病、自身免疫性肝炎、酒精性肝病者；（3）有心、肺、脑、肾等严重疾病者；（4）合并其他恶性肿瘤者；（5）合并其他自身免疫性疾病者。

同期选取在唐山市传染病医院治疗的非HBV感染患者82例为对照组。其中男45例，女37例，男女比例为1∶0.8；年龄18～77岁，平均（39.2±12.2）岁。纳入标准：非HBV感染的新入院患者。排除标准：同乙肝患者的排除标准。

所有研究对象签署知情同意书，本研究经华北理工大学医学伦理委员会审批通过。

1.2 研究方法

1.2.1 一般资料收集 收集患者一般资料，包括性别、年龄。

1.2.2 血液标本采集 抽取患者入院当天清晨空腹静脉血5 ml，全血标本室温放置2 h或4 ℃冰箱过夜后3 000 r/min离心20 min（离心半径10 cm），取上清液，置于-80 ℃冰箱冻存待用。

1.2.3 指标检测

1.2.3.1 血清HBV-DNA载量检测 取500 μl血清至1.5 ml灭菌离心管，再取100 μl血清加入等量的DNA浓缩液（中山大学达安基因股份有限公司）至1.0 ml的灭菌离心管内，震荡混匀5 s，6 000 r/min离心20 s（离心半径10 cm），去上清液，加入30 μl的DNA提取液，静置30 min后，震荡5～10 s，放入100 ℃的恒温箱中保温10 min，10 000 r/min离心5 min（离心半径10 cm），使用ABI7500实时荧光定量PCR仪（美国应用生物系统公司）扩增，使用乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒（中山大学达安基因股份有限公司，本试剂盒的最低检出限浓度为30 copies/ml，最低定量浓度为100 copies/ml）、PCR-荧光探针法检测血清HBV-DNA载量。

1.2.3.2 肝功能指标检测 采用Hitachi 7170全自动生化仪（日本日立公司）检测丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、γ-谷氨酰转肽酶（γ-GT）、碱性磷酸酶（ALP），严格按照仪器说明书操作。

1.2.3.3 ERS相关指标检测 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测ERS相关指标——葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、CCAAT/增强子结合蛋白（CHOP）、天冬半胱氨酸特异性蛋白酶-12（caspase-12），ELISA试剂盒由北京冬歌生物科技有限公司提供，按试剂盒说明书操作，具体步骤如下：（1）将所需板条在室温下平衡20 min；（2）设置标准品孔和样品孔，标准品孔加不同浓度的标准品50 μl；（3）样品孔先加待测样品10 μl，再加样本稀释液40 μl，空白孔不加；（4）除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100 μl，封固，37 ℃温育60 min；（5）洗板5次；（6）每孔加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min；（7）每孔加入终止液50 μl，15 min内在450 nm波长处用SpectraMax M5酶标仪（美国BioTek公司）测定各孔的OD值。以试剂盒中不同浓度的标准品的OD值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制出标准浓度曲线，按曲线方程计算各样本水平。

1.3 统计学方法 采用Excel 2013建立数据库，应用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料以（x ±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验；计数资料比较采用χ2检验；两变量间的相关性分析采用Pearson相关分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 阴性组、低拷贝组、中拷贝组、高拷贝组血清HBV-DNA载量分别为（185.0±145.7）、（1.8×104±2.7×104）、（2.5×106±2.7×106）、（3.0×108±1.8×108）copies/ml，患者例数分别为 42、33、29、32例。5组性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05，见表1）。

2.2 5组肝功能指标比较 5组ALT、AST、γ-GT比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；5组ALP比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。低拷贝组、中拷贝组、高拷贝组ALT、AST高于对照组、阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中拷贝组、高拷贝组ALT、AST高于低拷贝组，差异有统计学意义（P＜0.05）；高拷贝组ALT、AST高于中拷贝组，差异有统计学意义（P＜0.05）；阴性组、低拷贝组、中拷贝组、高拷贝组γ-GT高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表2）。

表1 5组一般资料比较〔n（%）〕Table 1 Comparison of general data in each group

表2 5组肝功能指标比较（x±s，U/L）Table 2 Comparison of liver function indexes in each group

2.3 5组ERS相关指标比较 5组GRP78、CHOP、caspase-12比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。阴性组、低拷贝组、中拷贝组、高拷贝组GRP78、CHOP、caspase-12高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；低拷贝组GRP78低于阴性组，差异有统计学意义（P＜0.05）；中拷贝组GRP78高于低拷贝组，差异有统计学意义（P＜0.05，见表3）。

表3 5组ERS相关指标比较（x±s）Table 3 Comparison of ERS related indexes in each group

2.4 相关性分析

2.4.1 肝功能指标与血清HBV-DNA载量相关性分析ALT、AST与血清HBV-DNA载量均呈正相关（P＜0.05）；γ-GT、ALP与血清HBV-DNA载量无直线相关关系（P＞0.05，见表4）。

2.4.2 肝功能指标与ERS相关指标相关性分析 ALT、AST、γ-GT、ALP与GRP78、CHOP、caspase-12均无直线相关关系（P＞0.05，见表4）。

表4 肝功能指标与血清HBV-DNA载量及ERS相关指标的相关性分析Table 4 Correlation analysis between liver function and HBV-DNA load and ERS indexes

3 讨论

病毒性肝炎位居我国传染病发病率之首，原国家卫计委数据显示，乙肝患者占所有肝炎患者的80%，我国每年因乙肝所致直接经济损失至少500亿元［6］。乙肝的发病机制尚不十分明确，现阶段研究表明，其发病机制主要是HBV的不断复制、持续表达和释放抗原引起肝细胞的持续性炎性反应，导致纤维组织持续增生，使肝细胞纤维化，最终导致肝硬化［7］。若不接受及时有效的治疗，25%～40%的慢性乙肝患者可进展为肝硬化或原发性肝癌并最终导致死亡［2］。研究显示，多种疾病的发生均与ERS有关，而肝细胞中含有丰富的内质网，许多肝脏疾病如病毒性肝炎、酒精性肝病、药物性肝炎、非酒精性脂肪肝等的发病机制均涉及ERS［8］。因此，本研究比较不同血清HBV-DNA载量乙肝患者的肝功能及外周血ERS相关指标变化，分析血清HBV-DNA载量对肝功能及外周血ERS相关指标的影响，以期为乙肝的临床诊治提供借鉴。

血清HBV-DNA阳性提示HBV复制和有传染性。血清HBV-DNA载量越高表示病毒复制越厉害，传染性越强。血清HBV-DNA载量及ALT等指标均是反映乙肝患者肝功能的重要指标［9］。本研究结果显示，低拷贝组、中拷贝组、高拷贝组ALT、AST高于对照组、阴性组，中拷贝组、高拷贝组ALT、AST高于低拷贝组，高拷贝组ALT、AST高于中拷贝组；阴性组、低拷贝组、中拷贝组、高拷贝组γ-GT高于对照组；5组ALP无差异。表明HBV的复制确实会在一定程度上影响肝功能，这与相关研究结果一致［10］。分析其原因可能为HBV感染会引起肝细胞损伤，而目前关于其机制的研究有以下两种观点：（1）肝细胞表面HBV抗原可引起人体的免疫应答，造成肝细胞损伤；（2）病毒大量复制造成其中间产物在细胞内累积，引发肝细胞损伤［11］。本研究结果亦显示，ALT、AST与血清HBVDNA载量均呈正相关，但其相关程度并不是很强（r值均＜0.500），而γ-GT、ALP与血清HBV-DNA载量无直线相关关系，可能与在分析过程中未将乙肝患者按临床分期分组统计有关，这需要后续研究进一步完善。

ERS通过诱导CHOP表达、GRP78及caspase-12的活化等一系列生物学效应信号使细胞由生存向凋亡转变。GRP78的迅速升高被认为是ERS最敏感的指标［12］。CHOP是联系ERS与细胞凋亡的重要中间信号分子，caspase-12仅在ERS时被活化，是介导ERS凋亡的关键蛋白酶，是ERS特有的凋亡途径［13］。既往体外实验及动物实验表明，HBV可诱导肝细胞发生ERS［14-15］，但是相关临床试验甚少［16］。本研究结果显示，阴性组、低拷贝组、中拷贝组、高拷贝组GRP78、CHOP、caspase-12高于对照组，这进一步在人体中证明了HBV可诱发ERS。但是本研究发现ALT、AST、γ-GT、ALP与GRP78、CHOP、caspase-12均无直线相关关系，分析这一结果的原因可能为ERS相关指标反映的是肝细胞的凋亡，而病毒复制的程度与肝细胞的凋亡进程并不一致。HBV感染的病程可分为4个阶段，即免疫耐受期、免疫清除期、非活动期及再活跃期。在免疫耐受期，血清HBV-DNA复制活跃，肝组织学无明显异常或仅有轻度异常；在免疫清除期，免疫耐受消失进入免疫活跃期，血清HBV-DNA载量下降，肝组织开始出现炎性坏死等；进入非活动期后，检测不到血清HBV-DNA载量或血清HBV-DNA载量低于检测下限，肝细胞坏死及炎症可缓解；部分患者会进入再活跃期，导致血清HBVDNA载量再次上升。

综上所述，乙肝患者血清HBV-DNA载量可对肝功能产生影响，且可诱发外周血ERS，这对乙肝的发病机制研究及临床诊治有一定的现实指导意义。但是，本研究所纳入的样本量有限，且仅对外周血ERS相关指标进行了检测，在今后的研究中可扩大样本量，对乙肝患者进行更为细致的分期研究，并检测肝组织中ERS相关指标的表达，以弥补本研究的不足之处，进一步探索ERS在乙肝发病及进展中的作用。

志谢：感谢唐山市传染病医院刘福忠、李小林老师在数据收集及标本采集过程中给予的帮助与支持。