超声波辅助提取红汁乳菇中酚类物质的工艺优化

2018-10-10熊国红何建国张啸怡

食品与机械 2018年8期

林海熊国红何建国张啸怡

(益阳市产商品质量监督检验研究院，湖南益阳 413000)

红汁乳菇(LactariushatsudakeTanaka)是担子菌纲、伞菌目、红菇科、乳菇属野生食用真菌。广泛分布于中国辽宁、河北、江苏、吉林、湖南、浙江、四川、青海和台湾等省[1-3]。由于其子实体味道鲜美且独特，富含人体所必须的维生素、氨基酸和矿物质[4-5]，深受人们的喜爱。红汁乳菇是一种外生食用菌根菌，由松树、杉树等针叶树种的根与菌根真菌形成共生体，由于生长条件的限制，其人工栽培至今未获得实质进展，市场上所出售的都是野生菌[6]。

目前关于红汁乳菇酚类成分及其生物活性的研究相对较少， Moro等[7]发现乳菇属真菌提取物具有较好的抗炎活性，能抑制炎症因子NO的产生，iNOS、IL-1β、IL6的表达；Palacios等[8]研究了8种食用菌中酚类物质的抗氧化活性，发现乳菇属真菌松乳菇的甲醇提取物对亚油酸自氧化抑制率高达50%；Cheung等[9]也通过对食用菌中多酚的研究发现多酚含量与其抗氧化活性呈正相关；已有研究[10]证明植物中的多酚也具备抗肿瘤作用，以及抑菌消炎、抗病毒、护肝益肾等生理活性。目前尚未发现关于红汁乳菇中酚类提取工艺优化的研究报道，本研究拟对红汁乳菇中酚类提取工艺进行优化，并研究其生理活性，旨在为红汁乳菇用作保健食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红汁乳菇：购买于长沙市马王堆农贸市场；

没食子酸标准品：含量≥97.5%，美国Sigma-aldrich公司；

钨酸钠、钼酸钠、浓磷酸、浓盐酸、硫酸锂、双氧水：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；

无水乙醇、甲醇：分析纯，天津市恒兴化学试剂制造有限公司。

1.2 仪器与设备

冰箱：BCD-190E型，伊莱克斯电器有限公司；

粉碎机：FW100型，北京科伟永兴仪器有限公司；

可见光分光光度计：721G型，上海仪电分析仪器有限公司；

离心机：TD4K-Z型，东旺仪器有限公司；

超声波清洗机：KQ-300DB型，昆山市超声仪器有限公司；

分析天平：SOPTOP型，舜宇恒平仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品鉴定在长沙市马王堆农贸市场所购买的样品，经由联川生物公司ITS测序，将其所测序列与美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotecnology Information)数据库比对后验证其为红汁乳菇。

1.3.2 红汁乳菇的处理将采得的新鲜红汁乳菇去除泥垢后，立即放入冰柜，使其中自由水在低温下结冰，将冻住的红汁乳菇置于真空冷冻干燥机中冻干处理，待真空冷冻干燥机达到其最低真空度6 Pa，并持续至少2 h后即可拿出，经粉碎机粉碎后过80目筛网。

1.3.3 总酚含量测定采用Folin-Ciocalteu比色法[11-13]，用没食子酸作为对照，配制成一定浓度后，与Folin-Ciocalteu显色剂反应2 h后，在760 nm吸收波长测定其吸光值，绘制相应标准曲线，其回归方程为y=0.014 67x+0.038 7，R2=0.999 7。由此方程算得红汁乳菇中总酚含量。并根据此含量算得酚类物质的提取得率。

提取率得率=提取物质量/提取原料质量。

(1)

1.3.4 单因素试验设计

(1) 溶剂及其浓度：称取红汁乳菇粉末1 g，分别加入不同浓度(30%，50%，60%，70%，80%，90%，100%)甲醇20 mL，室温下超声提取60 min，加入不同浓度(30%，50%，60%，70%，80%，90%，100%)乙醇20 mL，室温下超声提取60 min。

(2) 料液比：称取红汁乳菇粉末1 g，加入不同量的60%乙醇溶液(5，10，15，20，25，30 mL)，室温下超声提取60 min。

(3) 提取时间：称取红汁乳菇粉末1 g，加入60%乙醇溶液20 mL，室温下超声提取不同时间(20，40，60，80，100，120 min)。

(4) 提取次数：称取红汁乳菇粉末1 g，加入60%乙醇溶液20 mL，室温下超声提取60 min，分别提取1，2，3，4次。

1.3.5 响应面试验采用Box-Behnken设计，将总酚含量作为响应值，采用三因素三水平的设计，对提取时间、料液比、提取液浓度进行优化，由此推算出最佳条件，并验证其可靠性。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 提取溶剂的选择对提取效果影响由图1可知：不同浓度的乙醇、甲醇溶液对酚类物质的提取有显著的影响，这是由于不同浓度的甲醇、乙醇溶液有不同的极性，当极性与红汁乳菇中酚类物质的极性相似时，其相应的提取得率会提高[14]。总酚提取得率总体趋势呈现先上升后下降，这是由于一定浓度的有机溶剂能够破坏酚类与多糖和蛋白质之间的氢键和疏水作用力，使其提取量增加，而当浓度过高时导致其极性差异大反而使提取量减少[15]。

从选用提取剂的效果可明显看出来：乙醇>甲醇，且乙醇较甲醇来说是一种廉价、无毒的溶剂，故采用乙醇作为提取液。在乙醇浓度为50%～70%时，总酚的提取量能达到最高值，故选择乙醇浓度为50%～70%作进一步优化。

图1 溶剂对红汁乳菇总酚提取效果的影响Figure 1 Effects of solvents on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.2 料液比对提取效果的影响由图2可知：随着溶液提取体积不断的提高，酚类提取得率也不断上升，且上升趋势逐渐变缓。随着提取液增多，红汁乳菇粉末与溶剂接触更充分，且要使酚类析出到溶液而达到与低溶剂量相同的动态平衡状态需要析出更多的酚类，而料液比超过1∶20 (g/mL)时提取得率趋于稳定，说明此时酚类物质已基本溶出。

图2 料液比对红汁乳菇总酚提取效果的影响

图2 Effects of solid-liquid ratio on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.3 提取时间对提取效果的影响由图3可知：提取时间对红汁乳菇总酚提取效果的影响呈现出先上升后下降的趋势。在80 min以前提取量不断增加，而到了100 min以后提取量不断减少。由于物质扩散到溶液需要时间，固在80 min左右提取量呈现持续上升趋势，而随着时间的推移，超声提取产生热量导致提取温度不断的升高，且氧气与酚类反应的时间也相应加长，导致酚类氧化损失增多，提取得率下降[16]。因此提取时间应该在80 min左右。

图3 提取时间对红汁乳菇总酚提取效果的影响

图3 Effects of extraction time on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.1.4 提取次数对提取效果的影响由图4可知：随着提取次数的增多，酚类提取量虽然呈现上升趋势，但提取2次后上升趋势不太显著。随着提取次数的增多，导致溶剂消耗量陡增，且后期浓缩更费时费力，故只需提取2次。

图4 提取次数对红汁乳菇总酚提取效果的影响

图4 Effects of extraction times on the extraction of phenolics from Lactarius deliciosus

2.2 响应面优化结果及分析

根据选取的3个优化因素，以总酚含量作为响应值(Y)设计的Box-Behnken试验。其相应的因素水平和试验设计见表1、2。

2.2.1 二次回归方程及方差分析采用Design-Expert 8.0.6 Trial对试验的17组数据进行回归分析并拟合，得到：

Y=4.83+0.13A+0.30B-0.037C-0.089AB+0.037AC-0.11BC-0.54A2-0.16B2-0.20C2。

(2)

由表3可知，该模型P<0.000 1，表明该模型非常显著，是一个可靠的模型；A、B2、C2对响应值影响显著；B、A2对响应值影响极其显著；由F值的大小可以判断各因素对总酚提取量的影响大小依次是B>A>C；失拟项P=0.397 5>0.05，表明模型预测值与实际误差值较小，可以采用该数学模型来推测试验结果。

2.2.2 响应面结果分析由图5(a)可知，在一定的范围内，当料液比一定时，多酚提取量随提取时间的延长先上升后下降；当提取时间一定时，多酚提取量随溶剂量增大而增大。

由图6(a)可知，在一定的范围内，当料液比一定时，多酚提取量随乙醇浓度增大先上升后下降；当乙醇浓度一定时，多酚提取量随溶剂量增大而增大。

由图7(a)可知，在一定的范围内，当乙醇浓度一定时，多酚提取量随时间延长先上升后下降；当时间一定时，多酚提取量随乙醇浓度增大先上升后下降。

2.3 优化及验证

采用Design-Expert 8.0.6 Trial，通过设定提取总酚含量最大值，对超声波辅助提取多酚进行优化，得到最优条件为：乙醇浓度56.33%、料液比1∶25 (g/mL)、提取时间80.49 min、提取2次，总酚得率可达到4.993 65 mg/g。为便于操作，对最优工艺参数进行调整：乙醇浓度56%、料液比1∶25 (g/mL)、提取时间80 min、提取2次。