响应面法优化海带脱腥工艺及其色泽品质评价

顾赛麒，唐文燕，周洪鑫，张晨超，刘 璘，周绪霞，丁玉庭*

（浙江工业大学海洋学院，浙江 杭州 310014）

海带（Laminaria japonica）是一种生长于低温海水中的大型海生褐藻植物，其质地脆嫩，口感良好，营养丰富，含有多种生理活性成分，具有较高的药用保健功效，广受消费者青睐[1-2]。然而，新鲜海带腥味较重（远超淡水产品），降低了部分消费者对其喜好性，同时也对海带制品的感官品质造成了一定影响，阻碍了海带加工产业的发展[3]。

海带的腥味物质构成复杂，主要包括有机嗅代物或碘代物、醇类、醛类和烯酮类等[4-6]。目前，常采用物理法、化学法和生物法对海带进行脱腥处理[7]。物理法和化学法主要通过屏蔽、掩埋或吸收等方式降低腥味物质浓度，而生物法脱腥的原理是：1）将小分子的腥味物质经微生物的合成作用转变成为无腥味的大分子物质；2）在微生物酶的作用下，腥味物质分子经结构修饰后转变为无腥味成分。经对比发现，生物法的脱腥效果最好，其常用菌种有酵母菌、乳酸菌和醋酸杆菌等[7]，其中酵母菌的脱腥效果较优。国内外已有一些海带脱腥加工的相关报道，祖国仁等[8]报道采用3 种不同酵母菌对裙带菜浸提汁进行脱腥处理，发现均能有效去除腥味成分。段吴勇[9]利用0.70×108CFU/g的酵母菌对海带脱腥，发现在33 ℃发酵2 h时脱腥效果较好。Seo等[10]经研究证实微生物发酵是减少海带异味的有效手段。

在生物法脱腥过程中，若发酵条件（酵母添加量、发酵温度、发酵时间）控制不当，一方面可导致脱腥效率偏低，另一方面还可能对海带色泽造成不利影响（如绿色消失、褐色加深），分析原因：发酵过程中产生的酸类物质（碳酸等）可使发酵液的pH值显著下降，造成海带中叶绿素结构发生破坏（脱除镁离子或自身结构完全分解）[11]。此外，若发酵温度过高，也会对叶绿素结构造成不利影响。综上所述，选取适宜的发酵条件，在脱腥处理的同时尽可能保持海带原有色泽，可显著提高海带加工制品质量。然而，多数研究者在优化海带脱腥工艺的同时，未全面考察海带色泽相关指标（色差值、叶绿素含量等）的变化规律。

本实验选取不同工艺发酵后的海带作为研究对象，综合考察感官评分、pH值、色差、叶绿素含量的结果，确定各因素的较优作用水平。基于响应面设计获得海带发酵法脱腥的最优工艺，并进一步分析脱腥前后海带的挥发性风味成分变化，旨在为海带制品加工企业提供实验参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海带于2016年5月购自山东荣成寻山集团；酿酒高活性干酵母（货号：E80000012） 湖北安琪酵母股份有限公司；葡萄糖、氯化钠、丙酮、无水乙醇（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；C5～C40正构烷烃标准品、2,4,6-三甲基吡啶标准品（均为色谱纯）美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

HR2860型打浆机 德国飞利浦有限公司；220A型分析天平 瑞士Precisa仪器有限公司；YP3001N电子天平、PHS-3C型数显酸度计 上海精密科学仪器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省予华仪器有限公司；SKY-200B恒温振荡摇床 上海苏坤实业有限公司；LRH-250F生化培养箱 上海一恒科技有限公司；UV759紫外-可见分光光度计 上海奥普勒仪器有限公司；CQX3448色差仪 美国Hunter Lab公司；固相萃取整体捕集剂MonoTrap RCC18（简称MTRCC18，规格2.9 mm×5 mm，孔径1 mm） 日本GL Sciences公司；7890A-5975C气相色谱-质谱联用仪 美国Aglient公司。

1.3 方法

1.3.1 脱腥处理

酵母活化液的制备：称取20 g葡萄糖和0.6 g NaCl加入2 000 mL蒸馏水中，充分搅拌使其完全溶解，在上述溶液中分别加入1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g安琪酵母干粉，依次配制成质量分数为0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的酵母菌液（菌体浓度分别为7.85、8.15、8.32、8.45、8.54（lg（CFU/g））），将其置于转速为120 r/min的恒温摇床中，25 ℃活化20 min。

海带脱腥工艺：称取1 kg原料海带，将其剪成规格为1 cm×1 cm的小块。称取10 g剪碎后海带装入250 mL具塞锥形瓶中，向其中加入100 mL酵母活化液，将锥形瓶置于恒温摇床内，于不同温度（24、26、28、30、32 ℃）发酵脱腥不同时间（30、60、90、120、150 min）。将脱腥后的海带取出，以蒸馏水冲洗干净，并用纸巾擦干表面。以上海带一部分用于感官评定与色差测定，剩余部分在冰浴条件下打碎至均匀，用于其他指标的测定。

1.3.2 感官评定

参照Dooley等[12]的方法并稍作修改。召集10 名（5 男5 女，平均年龄24 岁）具有食品感官评定经验的人员组成评定小组，采用划线法对脱腥后的海带进行感官评定。各评价员在一根总长为10 cm的线段上进行划线，划线长度代表海带样品气味的“可接受度”（从腥味消除与异味生成两方面综合评定）。将划线长度除以10 cm再乘以100，转化后即可获得“可接受度”的百分制分数为受评海带样品的感官评分：满分100 分，表示样品气味完全可以接受；0 分表示完全不能接受。评定结果以10 名评价员打分的平均值表示。

1.3.3 pH值测定

将1.3.1节中脱腥完毕的海带发酵液以漏斗过滤，采用pH计测定滤液的pH值。

1.3.4 色差测定

参考师萱等[13]的方法。对于脱腥后的各组海带样品，每组随机挑选5 块色泽均匀、表面平整的海带（规格1 cm×1 cm），每块海带上随机选择3 个点，采用色差仪测定各点的L*、a*、b*值，并计算其色调值Hue=arctan（b*/a*）。以原料海带为对照样（CK），按式（1）计算脱腥后海带样品与对照样间的总色差值（ΔE*），测定结果以15 个测量点的平均值表示。

1.3.5 叶绿素含量测定

参考Jeffrey等[14]的方法并稍作修改。准确称取0.5 g打碎后的脱腥海带装入具塞试管中，向管内加入丙酮和无水乙醇按2∶1比例配成的浸提液，充分振荡，定容至25 mL，室温下避光浸提24 h。待浸提完毕后，用漏斗过滤浸提液，采用分光光度计测定滤液在645 nm和663 nm波长处的吸光度，根据公式（2）、（3）分别计算叶绿素a含量（Ca）和叶绿素b含量（Cb），并求得两者含量之和：

式中：D为对应波长下的吸光度；V为叶绿素浸提液体积（25 mL）；W为加入海带质量（0.5 g）。

1.3.6 响应面试验

在单因素试验的基础上，以酵母添加量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）作为自变量，为消除不同指标间的量纲差异，同时对感官评分与叶绿素a、b总含量指标进行离差标准化（min-max normalization，MMN）[15]，将两者标准化后的数值分别乘以各自的权重系数（0.75和0.25，由学校和企业专家共同开会讨论决定）后进行加和，其和值即为综合评分（Y），综合评分可作为模型的因变量（响应值），其最高分值为1 分。采用Box-Behnken设计3因素3水平的响应面试验（表1），对试验结果进行建模分析，以确定海带发酵脱腥的最优工艺。

表1 响应面试验因素与水平Table 1 Factors and levels used in response surface experimental design

1.3.7 整体材料吸附萃取-气相色谱-质谱联用（monolithic material sorptive extraction coupled with gas chromatography-mass spectrometry，MMSE-GC-MS）测定

1.3.7.1 萃取条件

参照顾赛麒等[16]的方法并稍作修改。准确称取2.0 g打碎后的脱腥海带，将其加入20 mL棕色顶空瓶中。选取4 个MTRCC18吸附子（空心圆柱体形状），以固定装置串联后置于顶空瓶内海带正上方。将顶空瓶置于恒温水浴锅中，60 ℃萃取1 h。待萃取完毕后，取下所有吸附子迅速装入热脱附管，再由前处理平台将热脱附管转移至热脱附器中进行热解吸进样。

1.3.7.2 仪器参数

热脱附器条件：不分流模式，初始温度40 ℃，以180 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。冷进样系统参数：液氮制冷，起始温度-40 ℃，平衡30 s，以12 ℃/s升至270 ℃，保留10 min。

GC条件：DB-5 MS毛细管柱（柱长60 m，内径0.32 mm，膜厚1 μm），汽化室温度240 ℃，不分流模式进样。起始柱温40 ℃，以4 ℃/min升至100 ℃，再以2 ℃/min升至150 ℃，最后以8 ℃/min升至240 ℃，保留5 min。载气为99.999%高纯氦气，载气流量1.0 mL/min。

MS条件：电子电离源，电子能量70 eV，全扫描模式，无溶剂延迟，质量扫描范围m/z 35～500，扫描速率3.0 scans/s，灯丝发射电流200 μA，离子源温度220 ℃，四极杆温度150 ℃，检测器温度250 ℃，传输线温度270 ℃，检测器电压1.2 kV。

1.3.7.3 定性方法[17]

将测定得到的挥发物质谱图与NIST和Wiley（2008）标准谱库进行比对，仅报道正反匹配度均大于800（最大值为1 000）的鉴定结果。同时计算各物质的线性保留指数（linear retention index，LRI）并与文献中的LRI值进行比对，LRI计算见公式（4）：

式中：Rt（x）、Rt（n）及Rt（n＋1）分别表示待测挥发性成分、含n 个碳原子正构烷烃及含（n＋1）个碳原子正构烷烃的保留时间。

1.3.7.4 定量方法

将10 μL质量浓度为10 mg/L的内标物2,4,6-三甲基吡啶（2,4,6-trimethylpyridine，TMP）加入到2 g海带样品中，通过计算待测挥发物与TMP峰面积的比值求得各挥发物的浓度（绝对校正因子设定为1），计算如式（5）所示：

式中：Ax、ATMP分别为待测挥发物与内标物TMP的峰面积；CTMP为加入TMP的质量浓度（10 mg/L）；VTMP为加入TMP的体积（10 μL）；mK为加入海带样品质量（2 g）。

1.3.7.5 气味活性值分析

气味活性值（odor activity value，OAV）反映各挥发物对样品整体气味轮廓的贡献程度，计算见式（6）：

式中：Ci和OTi分别为挥发物i的含量/（ng/g）和气味阈值/（ng/g）。OAV不小于1的化合物具有气味活性，可定义为气味活性物质[18]。

1.4 数据统计分析

采用SPSS Statistics 22.0和Design-Expert 8.0.5进行数据分析与处理，差异显著性分析由单因素方差分析（Oneway ANOVA）法完成；采用Origin 8.0软件进行作图。

2 结果与分析

2.1 发酵条件对海带感官评分的影响

图1 发酵条件对海带感官评分的影响Fig. 1 Effect of fermentation conditions on sensory score of Laminaria japonica

由图1A可知，随着酵母添加量的增加，发酵后海带样品的感官评分呈先上升后下降的趋势，当酵母添加量为0.15%时，感官评分达到最高，为70.4。段吴勇[9]结合电子鼻分析了不同酵母接种量对海带腥味感官的影响，结果表明随着酵母添加量增加，腥味逐渐减轻；当酵母添加量达到0.60×l08CFU/g时，脱腥效果最好；而当酵母添加量继续增加，则会产生不良的发酵异味。本研究中，评价员从腥味脱除与异味生成两方面对海带样品气味进行综合打分，分值高低反映了受评样品气味可接受度大小。随着酵母添加量的升高，一方面海带中的腥味物质可能会发生消降，另一方面新生成的异味物质也在不断积累（如酵母菌固有气味），当酵母添加量超过一定限值时（如大于0.15%），异味物质的生成速率可能超过腥味物质的消降速率，从而造成感官评分下降。综上可知，酵母添加量选择0.15%较佳。

由图1B发现，发酵温度在24～28 ℃范围内，感官评分始终呈上升趋势，28 ℃时达到最高（为70.4）；温度继续升高，感官评分有所下降但无显著性差异，这与段吴勇[9]的研究结果基本一致，分析原因：在较低温度（24～28 ℃）下，酵母增殖速率逐步增加，海带原有的腥味物质可能通过生物转化作用（合成反应或结构修饰）变成无腥味的物质，使得感官评分升高；当温度继续上升至30 ℃（酵母最适生长温度）时，酵母增殖速率达到最大，菌体数量快速积累[19]，发酵异味（酵母味等）不断加重，对海带气味产生不利影响，造成感官评分下降；发酵温度超过30 ℃，酵母菌体活性将受到抑制，增殖速率减缓，脱腥效果下降。综上所述，发酵温度选择28 ℃为宜。

由图1C可知，在30～120 min范围内，感官评分随着发酵时间的延长而不断增加（从49.0 分增至70.4 分），超过120 min，感官评分稍有下降但无显著性差异，分析原因：当发酵时间未满120 min时，随着发酵时间的延长，酵母菌体处于不断增殖过程，海带中原有的腥味物质可能经生物转化作用变为无腥味的物质，导致腥味物质不断消降。随着发酵时间继续延长，菌体数量由于积累效应进一步增加（酵母味加重），且酵母进入稳定期之后可能生成新的次生代谢产物，造成海带异味加重，导致感官评分下降。综上，发酵时间选择120 min较好。

2.2 发酵条件对海带pH值的影响

图2 发酵条件对海带pH值的影响Fig. 2 Effect of fermentation conditions on pH value of Laminaria japonica

由图2A可知，在0.05%～0.10%范围内，pH值随酵母添加量的增加而显著下降；当酵母添加量超过0.10%时，pH值稍有下降但无显著性差异。孔繁东等[20]通过实验证实，与发酵温度和发酵时间相比，酵母添加量对发酵液总酸含量影响最小。图2B结果与图2A类似，随着发酵温度的升高，发酵液pH值总体呈递减趋势；当发酵温度为30 ℃时，pH值降至最小值（6.81）；在26～32 ℃范围内，pH值无显著性差异。分析原因：随着发酵温度的升高，酵母活性增加，呼吸作用增强，产生的CO2溶于水后形成碳酸，造成发酵液pH值下降。30 ℃为酵母最适生长温度，此温度下发酵液的pH值最低。由图2C可知，pH值在30～150 min范围内持续下降，从7.25降至6.75，推测可能与酵母发酵过程中产生的CO2持续溶于水并形成碳酸有关。对比图2A、2B和2C可以发现，发酵时间对pH值的影响程度最大，显著高于发酵温度与酵母添加量，与孔繁东[20]和肖霄[21]等的研究结果相符。

在海带发酵脱腥过程中，pH值变化不仅会影响酵母活性[22]，还会对海带叶绿素含量造成影响：如叶绿素在酸性条件下结构会发生破坏（脱去镁离子甚至完全分解），导致a*值升高，绿色消失，海带色泽品质劣化。因此，有必要对海带发酵过程中色差和叶绿素含量等指标的变化进行研究。

2.3 发酵条件对海带色差的影响

由表2可知，不同条件下海带L*、a*、b*、ΔE*和Δa*值呈上升趋势，而Hue值呈下降趋势。海带中叶绿素含量较为丰富，故其色泽主要与a*值相关（a*正值代表红色，负值代表绿色）。为了更直观地反映发酵海带与原料海带间的a*值差异，计算Δa*值，Δa*值越大表示海带绿色消降越严重，产品色泽越差。由表2可知，随着酵母添加量的增大，Δa*值逐步升高；酵母添加量为0.15%时，Δa*值升至最大（0.18）；酵母添加量继续升高，Δa*值保持不变。在24～28 ℃范围内，Δa*值随着发酵温度的升高而不断增加，超过28 ℃后增幅放缓，表明较高的发酵温度会对海带色泽产生不利影响。陈丽丽[23]研究了温度对海带色差的影响，发现在24 ℃时，Δa*值较小；当温度升高到32 ℃时，Δa*值增至0.61，与本研究结果类似。除上述两类因素外，发酵时间对海带色泽也有重要影响。本研究中，在30～120 min范围内，海带样品的Δa*值增幅较小，超过120 min后Δa*值急剧增加，分析原因：酵母发酵过程中不断产生CO2，溶于水后生成碳酸，造成pH值持续下降。120 min之前可能发生叶绿素的脱镁反应为主，生成脱镁叶绿素（呈橄榄绿），导致Δa*值不断升高；120 min以后脱镁叶绿素结构可能进一步分解破坏，造成Δa*值急剧升高。将各发酵因素对海带色差的影响程度进行排序：发酵时间＞发酵温度＞酵母添加量。

表2 发酵条件对海带色差的影响Table 2 Effect of fermentation conditions on color difference of Laminaria japonica

2.4 发酵条件对海带叶绿素含量的影响

由表3可知，随着酵母添加量的增加、发酵温度的升高以及发酵时间的延长，无论是叶绿素a含量、叶绿素b含量还是两者含量之和，均呈不断下降趋势，表明酵母发酵处理对海带中的叶绿素具有明显的破坏作用。为更直观地反映各因素对叶绿素的影响，本研究基于叶绿素a和b的总消降率这一指标，对叶绿素的消降情况进行评价。在0.05%～0.20%范围内，叶绿素a和b的总消降率随着酵母添加量升高而显著增大，当酵母添加量超过0.20%时，叶绿素a和b的总消降率略有增大但无显著性差异。在24～32 ℃范围内，叶绿素a和b的总消降率随着发酵温度的升高而显著增大。潘柯伊等[11]指出：在20～40 ℃范围内，海带中的叶绿素对热较为稳定。据此推断，表3中出现的叶绿素含量随温度上升而下降的现象，可能源自酵母的分解作用，而非叶绿素自身的热降解效应。在30～150 min范围内，叶绿素a和b的总消降率随着发酵时间的延长而显著增大，这可能与酵母发酵过程不断产生CO2有关：CO2溶于水形成碳酸，碳酸不断积累，使得发酵液pH值持续下降（图2C）。酸性条件下，叶绿素中的镁离子可被氢离子置换出，变成脱镁叶绿素（当pH值继续降低时其结构甚至会完全破坏），从而导致海带绿色消失，色泽品质劣化。叶绿素含量变化规律可与2.3节中色差变化趋势一致。

表3 发酵条件对海带叶绿素含量的影响Table 3 Effect of fermentation conditions on chlorophyll content of Laminaria japonica

表4 a*与叶绿素含量的相关性分析Table 4 Correlation analysis between a* and chlorophyll content

由表4可知，无论是酵母添加量、发酵温度还是发酵时间，a*值与叶绿素含量间的相关系数均在0.7以上，表明两者结果一致性较好。此外，a*值与叶绿素a含量间的相关系数超过0.9，显著高于a*值与叶绿素b含量间的相关系数。分析原因：海带中叶绿素主要以叶绿素a为主（约占80%～90%），且叶绿素a和叶绿素b两者的呈色特性有所差异（前者呈蓝绿色，后者呈黄绿色）。根据表4中相关系数大小，对各发酵因素进行排序，结果显示：发酵时间＞发酵温度＞酵母添加量，表明发酵时间对a*值与叶绿素含量的相关性影响最为显著。

2.5 基于发酵后海带样品综合评分的响应面试验结果

2.5.1 响应面设计与建模分析

为进一步优化发酵条件，在上述实验结果的基础上，以酵母添加量（A）、发酵温度（B）和发酵时间（C）为自变量，发酵后海带样品的综合评分为响应值（Y），采用Box-Behnken设计3因素3水平响应面试验，结果见表5。利用Design-Expert 8.0.5软件对表5中的数据进行分析，结果见表6。对表6中数据进行二次多项回归拟合，即可建立各因素与响应值之间的二次多项回归方程：Y=0.83＋0.05A-0.11B-0.24C＋1.22AB＋0.08AC＋0.03BC-0.17A2-0.25B2-0.15C2。

表5 响应面试验设计与结果Table 5 Box-Behnken design and experimental results

表6 二次回归模型方差分析Table 6 Analysis of variance of quadratic regression model

由表6可知，所建二次回归模型的P值为0.000 2小于0.001，表明模型非常显著；失拟项P值为0.058 3大于0.05，表明模型失拟不显著，与实际拟合较好。回归模型的交互相AB（P=0.013 5）影响显著，一次项B（发酵温度，P=0.003 5）和C（发酵时间，P＜0.000 1）、二次项A2（P=0.002 0）、B2（P=0.000 2）和C2（P=0.005 0）影响极显著，其他一次项（A酵母添加量）和交互项（AC和BC）影响不显著，表明酵母添加量和发酵温度两因素间存在交互作用。此外，根据回归模型各因素的系数绝对值A 0.05、B 0.11 和C 0.24，可知各因素对感官评分的影响程度依次是：C＞B＞A，即发酵时间＞发酵温度＞酵母添加量。

2.5.2 两因素交互作用结果

图3 各因素交互作用对海带综合评分影响的等高线和响应面图Fig. 3 Three-dimensional response surface and contour plots showing the interactive effects of different factors on sensory score of Laminaria japonica

由图3a可知，酵母添加量与发酵温度对综合评分影响的交互作用显著（P＜0.05）。如图3b和3c所示，酵母添加量与发酵时间交互项、发酵温度与发酵时间交互项，均对综合评分的影响不显著（P＞0.05），这与表6方差分析的结果相一致。

通过响应面法得到酵母脱腥的最优工艺条件为酵母添加量0.17%、发酵温度27.96 ℃、发酵时间102.9 min，此条件下脱腥海带的综合评分Y最高，为0.92 分。

2.5.3 最优发酵工艺验证实验结果

考虑实际需要，对上述工艺条件进行调整，确定实际最优发酵工艺为：酵母添加量0.17%、发酵温度28 ℃、发酵时间100 min。在此条件下进行3 次验证实验以考察模型的可靠性，结果表明：实际最优工艺条件下，发酵海带感官评分为74.6 分，与原料海带的感官评分（24.5 分）比较，感官评分增加204.49%；而叶绿素总量由原料海带的3.83 mg/kg降至2.23 mg/kg，降低41.78%。综上可知，本研究确定的实际最优发酵工艺效果良好。

2.6 脱腥前后海带中的挥发性风味成分变化

采用MMSE-GC-MS法对脱腥前后的海带样品进行测定，共检出7 大类43 种挥发性风味成分（表7），其中OAV不小于1的气味活性物质有11 种，包括5 种直链醛（己醛、庚醛、辛醛、壬醛和癸醛）和1 种烯醛（2-壬烯醛）、2 种烯醇（1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇）、1 种酮类（2-庚酮）、1 种芳香类（联苯）以及1 种杂环类（2-乙基呋喃）。采用优化后的发酵工艺：酵母添加量0.17%、发酵温度28 ℃、发酵时间100 min，对海带进行脱腥处理，结果显示：无论是挥发物种类、总浓度还是OAV总和均显著下降，具体而言，挥发物种类减少一半左右，从43 种降至23 种；挥发物总含量大幅下降，从287.65 ng/g降为151.92 ng/g；气味活性物质减少3 种（2-辛烯-1-醇和2-庚酮被完全脱除，2-乙基呋喃丧失气味活性）；OAV总和从91.75降至55.28，降幅接近40%。进一步分析表7可知，化合物自身结构特性可能对其脱除效果影响显著，以OAV消降值排序：醛类（23.62）＞＞醇类（7.58）＞芳香类（2.43）；以OAV脱除率排序：酮类（90.70%）＞＞杂环类（62.44%）＞烃类（57.26%），但机理有待深入研究。

表7 MMSE-GC-MS法鉴定脱腥前后海带中的挥发性成分Table 7 Volatile components identified by MMSE-GC-MS of Laminaria japonica before and after deodorization detection

续表7

醛类因其阈值较低，通常对海带的整体气味具有重要贡献。由表7可知，脱腥前后海带样品中醛类物质总含量以及OAV总和均占所有化合物首位，检出的11 种醛类均被相关文献证实，表明醛类可能是表征海带腥味的关键气味物质。由表7可知，己醛是海带中含量最高的醛类化合物（超过30 ng/g），与刘智禹等[28]的报道相符。高浓度的己醛可使海带具有鱼腥味、青草味等不良气味[31]，经优化发酵工艺处理，海带样品中己醛含量显著下降，OAV消降值也较高，达1.64。除己醛外，庚醛、辛醛和癸醛等直链醛的浓度在脱腥后也发生了显著下降，其中庚醛和辛醛两者气味特征相似（同呈鱼腥味），经脱腥后两者OAV消降值分别为1.52和1.37（与己醛接近，占据醛类物质前列），表明它们可能在海带脱腥过程中贡献显著。

醇类是海带挥发性风味的重要组成。发酵后海带样品中醇类物质由5 种降为2 种，总含量由36.87 ng/g降为15.88 ng/g，OAV总和由16.34降到8.76（OAV消降值为7.58，脱除率接近50%）。段吴勇[9]经实验证实：发酵后海带样品中所含的醇类物质种类大幅减少，浓度降低。据报道，1-戊烯-3-醇和1-辛烯-3-醇是海带中主要的气味物质[28]，后者呈典型的鱼腥味和青草味，可能对海带整体腥味贡献显著。本研究中，以优化工艺发酵后，海带中两种气味活性醇类1-辛烯-3-醇和2-辛烯-1-醇OAV均显著下降（OAV消降值分别为3.50和4.02，脱除率各自达25.87%和100%）。上述两种烯醇结构十分相似（为同分异构体），但它们的气味特征和脱除率却相差较大，原因有待探明。

酮类也是海带挥发性风味的组成成分。发酵后海带样品中酮类物质种类由9 种减少为3 种，总含量由47.84 ng/g降为9.13 ng/g，OAV总和由1.72降到0.16。虽然酮类的OAV脱除率极高（90.70%），但其OAV总和较小，故对海带整体气味影响不大。2-庚酮是酮类中唯一的气味活性物质，经发酵后完全被脱除。1-辛烯-3-酮是含量最高的酮类化合物（14.76 ng/g），呈鱼腥味，对海带腥味具有一定贡献，以优化工艺发酵后，海带样品中1-辛烯-3-酮的脱除率为100%，与段吴勇[9]的研究结果类似。

芳香类和烃类由于自身气味阈值普遍偏低，故可能对海带挥发性风味贡献较小。由表7可知，从原料海带中分别检出了9 种芳香类和5 种烃类物质，总含量分别为67.06 ng/g和26.15 ng/g。除联苯外，所有芳香类和烃类物质的OAV均小于1，表明其对海带整体腥味贡献较小。值得注意的是，脱腥前后海带样品中联苯的OAV始终保持较高水平（分别为6.74和4.74），推测原因：联苯为海洋环境污染物，通过生物富集作用在海带中富集，且采用酵母发酵法难以脱除联苯。

2-乙基呋喃是海带的气味活性物质之一，属环氧杂环类化合物，呈辛辣的橡胶味。采用优化工艺发酵后，海带中该物质的OAV已降至1以下（0.77），表明其气味活性已丧失。二碘甲烷是原料海带中被唯一检出的含碘挥发物，有特殊的刺激味，在发酵后的海带样品中未被检出，脱除率达100%。

3 结 论

通过酵母发酵工艺对海带进行脱腥处理，综合考察了酵母添加量（0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%）、发酵温度（24、26、28、30、32 ℃）和发酵时间（30、60、90、120、150 min）3 个因素对海带感官评分、pH值、色差、叶绿素含量的影响，结果表明发酵时间对海带样品的感官评分和色泽品质影响最大，发酵温度次之，酵母添加量最小。运用Box-Behnken 3因素3水平的响应面试验设计，将感官评分与叶绿素总量两项指标进行离差标准化后再加权求和，计算其综合评分作为模型响应值，确定了海带发酵的实际最优工艺：酵母添加量0.17%、发酵温度28 ℃、发酵时间100 min。该工艺下发酵海带感官评分为74.6 分，原料海带为24.5 分（增幅达204.49%），叶绿素总量为2.23 mg/kg，原料海带为3.83 mg/kg（降幅为41.78%），发酵效果总体良好。采用MMSE-GC-MS法分析了发酵前后海带样品中的挥发性风味成分，共检出7 大类43 种挥发物，确定己醛等11 种气味活性物质（OAV≥1）。与原料海带相比，发酵后海带中挥发物种类从43 种降至23 种，挥发物总含量与OAV总和分别下降135.73 ng/g和36.47，降幅分别为47.19%和39.75%，脱腥效果显著。化合物自身结构特性可能对其脱除效果影响显著，发酵海带样品中醛类的OAV消降值最大（23.62），而酮类的消降率最高（90.70%），原因有待后续深入探讨。