Caspase家族与细胞凋亡的研究进展

杨涛 费振海 钟兴明

细胞凋亡又称为程序性细胞死亡，是细胞维持生命活动的重要过程。细胞凋亡对器官组织的生长发育、免疫、新陈代谢以及非正常细胞的清除具有重要意义。而细胞凋亡的诱导与执行需要一系列蛋白分子信号共同作用，如信号分子、受体、蛋白酶、基因等。Caspase是一种促使细胞凋亡的蛋白酶[1-2]，在细胞凋亡机制网络中处于核心地位[3]。Caspase的活化和Caspase级联反应能被多种凋亡抑制信号调控，如Bcl-2蛋白家族、钙蛋白酶、Ca2+等。笔者就 Caspase家族、Caspase级联反应系统及Caspase蛋白分子调节作一综述。

1 Caspase的分子结构及性征

Caspase是一种半胱氨酸蛋白酶[4-5]，也是一种IL-1β转化蛋白酶，与秀丽隐杆线虫的细胞死亡基因CED-3具有高度同源性。目前已被发现的Caspase有14种[6]，按发现顺序依次命名为Caspase-1～Caspase-14，并且它们具有部分相同的分子结构与性征：（1）都是半胱氨酸天冬氨酸酶；（2）都有一个保守的五肽反应位点′QACXG′；（3）前体蛋白都是酶原。

Caspase的N末端原结构域（Prodomain）包含着一个高度多样化的结构。一般蛋白酶的活化通过切割Prodomain即可，但Caspase的活化不仅需要把N末端Prodomain切除，还需要在两个亚基连接处对相对应的天冬氨酸序列位点进行切割，完全切除后的Caspase才有蛋白酶活性。两个亚基连接处的天冬氨酸序列位点被切割后，Caspase会产生包含一个大亚基和一个小亚基的一个异二聚体，而两个异二聚体可组成一个有酶活性的异四聚体。根据Caspase氨基酸序列的同源性及其作用性质，可将Caspase分为3个亚型，见表1。

表1 Caspase家族的亚型分类

在众多的细胞凋亡活化者和炎症反应调节者中，都具有一段较长且重要的Prodomain[7]，其中Procaspase-8、Procaspase-10包含死亡效应域（DED），而 Procaspase-2、Procaspase-9包含着募集结构域（CARD）。DED与CARD都是死亡结构域家族成员，它们能经过蛋白质的相互结合反应、自我活化或活化其他对应的Procaspase，进而调控下游的Caspase级联反应。在斑马鱼Procaspase的Prodomain中，发现了与上述两种结构域相似的热蛋白结构域（PYD）[8]。这3种结构域都有一个共同的3D折叠结构，由6个反平行α螺旋组成。此外，有研究发现部分凋亡执行者Procaspase中的Prodomain并不参与蛋白质相互之间的结合反应[8]。

2 Procaspase的活化

Procaspase的活化路径主要有两种：（1）死亡信号诱导，死亡受体依赖性路径；（2）细胞色素C诱导，线粒体调节路径（Caspase-9依赖性路径）。

2.1 死亡受体依赖性Procaspase活化路径

2.1.1 Procaspase-8、Procaspase-10的死亡受体依赖性活化路径 细胞死亡信号（如Fas配体、TNF-2）能被其位于细胞膜的特异性死亡受体（如Fas、TNFR）所识别。两者之间的相互结合可以活化相关死亡受体，如Fas、TNFR均能与其相关性死亡结构域结合，从而导致这些相关性死亡结构域相聚合并产生大量DED。而DED又能与Procaspase-8的Prodomain中DED相互作用，诱导位于细胞质中的Procaspase-8蛋白质进行寡聚反应，最终产生大量的死亡诱导信号复合体（DISC）。在DISC中，两个线性结构的Procaspase-8紧密结合，同时进行Procaspase-8蛋白质的自我活化。Caspase-8活化后的下游路径具有不同的细胞类型，如在一些淋巴样细胞系中，Caspase-8被大量活化并能直接活化下游的Procaspase；在其他细胞类型中（不同于淋巴样细胞系），Caspase-8只被少量活化，且不能直接活化Caspase-3。然而，Caspase-8除活化Caspase-3外，还能通过切割细胞基质中的Bcl-2蛋白家族成员Bid前体来形成截断的Bid（tBid），tBid能进入线粒体中，致使Bax等相关蛋白进行寡聚反应，诱导细胞色素C，同时凋亡诱导因子AIF及其他相关凋亡信号分子从线粒体中释放，进而诱导细胞凋亡。

Caspase-10主要诱导淋巴样细胞凋亡，其诱导的凋亡路径与Caspase-8相似[9]。Caspase-10在Fas与TNF相关性诱导凋亡（如Fas相关介导的人T细胞凋亡）的过程中，能引起Procaspase-10的募集与活化，与Caspase-8同时活化并作用于下游底物。虽然Caspase-8和Caspase-10都能接受死亡受体产生的凋亡诱导信号，从而诱导细胞凋亡；但它们拥有不同的凋亡作用底物，同时面对死亡信号及其他类细胞凋亡过程中所呈现的功能也不相同。

2.1.2 Procaspase-2的死亡受体依赖性活化路径 一旦死亡信号与其受体相结合，死亡信号受体即被活化。这些活化的死亡信号受体可通过受体相关作用性蛋白等方式募集Procaspase-2，而募集后的Procaspase-2可被活化。

2.2 细胞色素C诱导、线粒体介导性Procaspase活化路径

2.2.1 细胞色素C诱导、线粒体介导性Procaspase-8活化路径 除了与死亡复合体结合并自我活化外，Procaspase-8也能被其他方式活化，如细胞色素C诱导、线粒体介导途径。当细胞色素C从线粒体释放到细胞质中，可以通过活化Procaspase-6的Prodomain而活化Caspase-6，活化后的Caspase-6又能进一步活化Caspase-8。可见，Caspase-8的活化既能通过与死亡复合体结合实现自我活化，也能通过细胞色素C诱导、线粒体介导途径活化。

2.2.2 细胞色素C诱导、线粒体介导性Procaspase-9活化路径 当发生细胞应激性反应（如DNA损伤、感染）时，线粒体膜会出现肿胀、通透性增高，线粒体的通透性转换膜开放，致使位于线粒体内的细胞色素C、AIF、Bitl等物质释放至细胞质中[10-11]。位于细胞质中的细胞色素C、dATP、Apaf-1可与 Procaspase-9组成一种大分子混合物凋亡体。Apaf-1的N段与Procaspase-9的Prodomain均有CARD，它们按1∶1的比例进行相互作用，并组成大分子混合物。活化后的Caspase-9能活化下游的Procaspase-3、Procaspase-7，而活化后的Caspase-3又能进一步活化Procaspase-9，从而形成一种正反馈调节。

在线粒体调控活化路径中，Apaf-1是凋亡小体最主要的组成部分。Apaf-1有3个独特的结构域，即N段募集结构域、一个核苷酸结合域、一个WD-40功能位点片段。目前已发现4种不同的Apaf-1亚型，且它们均有上述3种特殊结构。N段募集结构域需与Procaspase-9的Prodomain相结合，从而导致Procaspase-9的募集与活化。核苷酸结合域的顺序与秀丽隐线虫的CED4相似，因此该区域又称为CED4同源性区域，该区域存在细胞色素C与dATP的条件下，能使Apaf-1进行寡聚反应。Apaf-1单独与dATP相结合的能力较差，但有细胞色素C的条件下，其结合能力大大增强，同时Procaspase-9对它们的结合起着推动作用[12]。WD-40功能位点片段主要涉及Apaf-1与细胞色素C的相互作用[13]。目前已有研究涉及Caspase-9的活化。在正常生理情况下，不活跃的Caspase-9主要以单体形式存在，但当Caspase-9人为形成或被Apaf-1募集，则Caspase-9二聚体的形态将导致Caspase-9的活化[14]。

3 级联反应下游中的Caspase

上游凋亡始动者的活化能进一步活化下游的凋亡执行者。此外，活化的Caspase-8能通过切割Bid前体而形成tBid，诱导细胞色素C、AIF及其他相关凋亡信号分子从线粒体中释放，最终诱导细胞凋亡。而活化的凋亡执行者可剪切对应相关的细胞蛋白，如聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（PARP）、核纤层蛋白（Lamin）、胞衬蛋白（Fodrin）、Bcl-2，从而促使细胞发生形态学变化。下游中参与炎症反应的 Caspase（如 Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5）可诱导相关炎症介质因子IL-1β转换酶原的活化[15]。

3.1 Caspase-3、Caspase-6 和 Caspase-7 Caspase-3是最为关键的细胞凋亡执行者，它在细胞凋亡的过程中具有关键作用[16-18]。Caspase-3由Procaspase-3活化而来，而 Procaspase-3 可被 Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9、Caspase-10等活化。Caspase-3的作用底物包括Procaspase-3、Procaspase-6、Procaspase-9、依赖于脱氧核糖核酸的蛋白激酶（DNA-PK）、蛋白激酶 C（PKC）、PARP等。大部分Caspase-3的作用底物均可被Caspase-3水解分离，可见Caspase-3在细胞凋亡过程中有着重要作用。

Caspase-6、Caspase-7与Caspase3具有高度同源性。Procaspase-6能被Caspase-3活化但不能被颗粒酶B活化。Caspase-6也能通过正反馈调节进一步活化Procaspase-3。Caspase-6 的作用底物包括 PARP、Lamin、Procaspase-3。Procaspase-7可被颗粒酶B活化，其作用底物包括PARP、Procaspase-6等。

3.2 下游Caspase的作用底物 下游Caspase的作用底物包括PARP、DNA-PK、U1-70kD等，它们对细胞DNA的错配修复有着重要作用。当这些底物被Caspase分解灭活后，DNA降解将不可避免。被Caspase活化后的脱氧核糖核酸酶（CAD）是一种基本的、镁离子依赖性的核酸内切酶。在哺乳动物DNA降解过程中，CAD起着促进作用。在正常细胞中，CAD主要位于细胞核内，并与相关特异性抑制剂结合成一种复杂的CAD抑制物（ICAD）。当发生凋亡时，Caspase-9通过某些方式损伤细胞核核孔，帮助Caspase-3进入细胞核并水解ICAD。被Caspase-3水解分离后的ICAD可释放出CAD，从而导致DNA降解。Lamin A、Fodrin分别是细胞核、细胞质骨架的基本组成部分，它们一旦被Caspase水解分离，就会导致细胞核的浓缩、细胞核核膜的分解及凋亡小体的产生。当所有Caspase底物被分解或灭活后，细胞会产生一系列形态学改变，包括相关凋亡基因的活化、DNA错配修复的减少、相关凋亡酶原的活化、抑制凋亡酶原的失活、细胞骨架分离、细胞核破碎等，最终导致细胞凋亡。

4 Caspase-2的功能

Caspase-2是哺乳动物中早期发现的Caspase蛋白水解酶。Caspase-2具有特殊的结构形态，它既是Caspase启动子又是效应子。Caspase-2在细胞凋亡的早期即可出现，如DNA损伤、TNF出现及其他相关病原体或病毒感染时。Caspase-2、Caspase-9与秀丽隐线虫的CED-3相似，都有一个高度同源性的Caspase募集结构域。Caspase-2分布在多种组织和细胞中，细胞核、细胞质内均有存在，甚至还是高尔基复合体的重要组成部分。研究发现Caspase-2在一些细胞中可充当凋亡诱导者。Read等[19]报道在一些细胞中并无细胞色素C或Apaf-1的存在，但存在着Procaspase-2自发性募集并形成蛋白质复合体，这些蛋白质复合体又能活化Procaspase-2。Procaspase-2经自我活化后，活化的Caspase-2又能进一步活化Caspase-9，从而导致线粒体内的细胞色素C及其他相关诱导凋亡因子的释放。Gabriela等[20]研究发现在凋亡早期，位于细胞核内的Caspase-2可不离开细胞核即致使细胞线粒体功能障碍，诱导释放细胞色素C，从而促进凋亡；只有在凋亡晚期，Caspase-2才从细胞核内转移至胞内。Guo等[21]发现一定生理量的Caspase-2也能产生tBid，从而诱导凋亡。Bcl-2可以抑制Procapsae-2的活性，Bcl-2可以抑制线粒体内诱导因子的释放并维持正常线粒体外膜的通透性，活化的Paspase-2可以截断Bcl-2家族蛋白，形成tBid，进一步促进线粒体内诱导因子释放的同时也促进了自身活化，形成一个正性反馈。可见，对于Bcl-2限制线粒体外膜通透性的功能来说，其抑制Procaspase-2活性的功能更为关键。此外，研究发现Caspase-2不仅与Caspase-9的活化有关，它在Fas调控凋亡过程中也能促使死亡诱导信号复合体的产生，进而促进Procaspase-8的活化[22]。

5 Caspase-12及内质网应激性诱导凋亡

内质网参与维持细胞内Ca2+浓度、合成细胞膜上蛋白等多种功能。此外，它对细胞凋亡信号的处理也有着重要作用。

Caspase-12主要集中在内质网中，并受内质网应激性反应来调节凋亡发生，它对许多神经系统性疾病的发生有着重要影响。内质网的应激性反应受多种因素的影响，如多种未折叠蛋白质累积在内质网的内腔中会扰乱Ca2+平衡，而其他药物（如毒胡萝卜素、顺铂类）等也可引起内质网的应激性反应。

目前发现在多种细胞类型中出现内质网应激性凋亡并促使Caspase-12的活化。在衣霉素导致的内质网应激性凋亡过程中，Procaspase-12活化，使得Caspase-12转移至细胞核内，而Caspase-12可以进一步活化Caspase-3，最终诱导细胞凋亡。在内质网应激性反应的作用下，Caspase-7可从细胞质基质中转移至内质网表面，通过与Procaspase-12相互作用而活化Caspase-12，在此过程中主要由于内质网失常，不受线粒体或其他部位凋亡信号的影响[23]。在内质网应激性凋亡过程中，线粒体的功能也随之改变。Nobuhiro等[24]报道在鼠科动物细胞C2C12中，Caspase-12经内质网应激性凋亡被活化后，进而活化Caspase-9，活化后的Caspase-9再活化Caspase-3、Caspase-6和Caspase-7。在这些Caspase相互活化的过程中，并未发现细胞色素C从线粒体中释放，提示细胞色素C与Caspase-9的活化无关。

6 Caspase系统的调节因子

Caspase的活化与灭活均可被一些蛋白质、离子及其他相关类因子[如凋亡抑制因子（IAP）、Bcl-2蛋白家族、钙蛋白酶及Ca2+、颗粒酶B、细胞因子效应调节剂A、杆状病毒p35]所调控。

6.1 IAP IAP是哺乳动物的一种内源性Casapse抑制剂，可特异性抑制Casapse-9、Casapse-7、Casapse-3的活性，从Casapse的始动阶段即开始抑制，最终达到抗凋亡的作用。目前，人体中被发现的IAP成员包括cIAP1、cIAP2、XIAP（X与哺乳动物中被抑制的凋亡蛋白质种类有关）、NIAP、Survivin和Livin。IAP家族结构的共同特点是N端含有1或3个包含70个氨基酸的杆状病毒IAP重复序列（BIR），C端包含或不包含1个指环结构。BIR中具有锌指结构，可与锌离子螯合，并能与Caspase特有的氨基酸序列或连接部位的表面相结合，以达到下调与阻断Caspase活性的作用。同时，并不是所有BIR结构蛋白都有抑制凋亡的作用，如Survivin也有一个BIR结构，但它主要起调节细胞的有丝分裂而非抑制凋亡的作用。

哺乳类动物的IAP活性也可被线粒体释放的半胱氨酸蛋白酶活化剂（Smac/DIABLO）所抑制。Smac/DIABLO的N段存在着一段4个残基序列（Ala1-Val2-Pro3-Ile4），能使其识别并与已结合XIAP的Caspase-9相结合，促使XIAP失活，从而逆转XIAP对Caspase-9的抑制作用。此外，Uren等[25]报道位于酵母菌中的IAP既没有与Casapse结合的功能，也没有促进细胞凋亡的作用。

6.2 Bcl-2蛋白家族 Bcl-2蛋白家族是一类凋亡调控蛋白质[26-27]。根据Bcl-2蛋白家族功能及结构的不同，可分为两大类：（1）第一类Bcl-2蛋白为抑制凋亡的蛋白质，包括哺乳动物中的 A1/Bfl1、Bcl-2、Bcl-w、Bcl-xL、Boo/Diva、Mcl-1、NR-13、Nrf3，细菌中的 BHRF-1、E1B19K、Ks-Bcl-2、LMW5-HL、ORF16，秀丽隐线虫中的CED-9；（2）第二类Bcl-2蛋白为促进凋亡的蛋白质，包括哺乳动物中的 Bad、Bak、Bax、Bcl-rambo、Bcl-xS、Bid、Bik、Bim、Blk、BNIP3、Bok/Mtd、Hrk、Nip3，秀丽隐线虫中的Egl-1。第一类Bcl-2蛋白都有4个短小的Bcl-2 同源结构域，即 BH1、BH2、BH3、BH4；此外，它们抑制凋亡作用的主要机制是抑制Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白的功能。第二类Bcl-2蛋白中的Bax、Bak，主要位于细胞质内，在凋亡程序开始时可转移至线粒体外膜上，并在转移的过程中发生一些形态变化、寡聚反应并嵌入线粒体外膜中，从而提升线粒体通透性转移膜的渗透性。第一类Bcl-2蛋白能通过抑制Bax蛋白活性来阻止其嵌入到线粒体外膜上，维持线粒体通透性转移膜的正常渗透性，进而阻止相关线粒体促凋亡因子如细胞色素C、AIF、Smac/DIABLO的释放。通过抑制上述促凋亡因子的释放，Bcl-2蛋白家族可抑制Caspase蛋白的活性，进而起到抗凋亡的作用。

6.3 钙蛋白酶及Ca2+钙蛋白酶是一种Ca2+依赖性半胱氨酸蛋白酶，属木瓜蛋白酶类。目前普遍认为在细胞坏死与细胞凋亡过程中存在钙蛋白酶的活化。钙蛋白酶和Casapse-3具有部分共同的作用底物，如Fodrin、Ca2+依赖性蛋白激酶、ADP-核糖转移酶/PARP。在内质网应激性凋亡过程中，钙蛋白酶的作用尤为明显。当老鼠大脑单侧存在局部缺氧时，钙蛋白酶首先将Procaspase-3分解成有活性的29kDA片段，然后进一步活化Caspase-3[28]。顺铂类药物是一种肿瘤化疗药，它能导致内质网应激性凋亡的产生，在此凋亡过程中，Procaspase-12的活化依赖于Ca2+浓度及钙蛋白酶的活性。此外，钙蛋白酶也能分解Bcl-xL，使其从抑制凋亡状态转变为促凋亡状态[29]。

6.4 颗粒酶B、细胞因子效应调节剂A及杆状病毒p35 颗粒酶B是一种丝氨酸蛋白酶，它在细胞毒性T细胞的凋亡过程中起着关键作用。颗粒酶B可活化各种 Procaspase（如 Procaspase-3、Procaspase-7、Procaspase-8、Procaspase-9、Procaspase-10），从而促进凋亡的发生。Barry等[30]发现颗粒酶B可以分解相关Bcl-2家族蛋白，开启线粒体介导凋亡途径。

细胞因子效应调节剂A是一种从牛痘病毒分离出的丝氨酸蛋白酶抑制剂，可以抑制颗粒酶B的活性。细胞因子效应调节剂A对Caspase-1、Caspase-8的抑制作用较强，对Caspae-3、Caspase-6的抑制作用较弱，同时它可以阻止Fas与配体交联并灭活颗粒酶B。

杆状病毒p53可与Caspase-1～Caspase-8相结合，并灭活这些蛋白活性，作用范围较广。但目前尚未明确p53与这些Caspase蛋白相结合的机制，以及它们与相关促进或抑制凋亡因子的关系。

7 小结

细胞凋亡对生理性胚胎发育、免疫细胞分化、自身免疫系统维持、肿瘤发生及神经系统损伤等具有重要意义。而Caspase家族在细胞凋亡过程中居于重要地位。笔者就近年来Caspase相关研究进展作一综述，以进一步提高对Caspase分子结构的认识，加深对Caspase参与细胞凋亡过程的理解，为未来治疗肿瘤、自身免疫性疾病、神经系统疾病等提供突破口。