5-氨基酮戊酸光动力抗感染化学疗法对中型无绿藻抑制作用的体外研究

刘泽虎 钟燕 智慧林 桑波 李秋萍 吕闻闻 夏修蛟 沈宏

光动力治疗最初用于肿瘤治疗[1]。目前光动力抗感染化学疗法越来越多被应用于对抗生素耐药的细菌、病毒、原虫及致病性真菌感染[2]。近期国内外研究表明，光动力抗感染化学疗法在许多难治性或复发性的皮肤浅表及皮下深部真菌感染中取得了良好疗效。中型无绿藻是导致无绿藻病的主要病原菌，而目前治疗无绿藻病的主流方法依然是使用抗真菌药物，但是治疗难度非常大[3]。鉴于5-氨基酮戊酸光动力治疗已取得美国食品药品管理局和中国食品药品监督管理总局的批准，目前已广泛应用于临床，因此笔者尝试探讨该疗法体外对中型无绿藻是否具有抑制作用，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 菌株收集及鉴定 共收集7株中型无绿藻（CMCCC O22a、O22b、O22c、O22d、O22e、O22f、O22g），均由中国医学科学院皮肤病研究所中国医学真菌保藏中心惠赠。所有无绿藻菌株通过同化试验及26S rDNA D1/D2区序列测序鉴定到种[4]。

1.2 5-氨基酮戊酸配制 用双蒸水避光条件下配制5-氨基酮戊酸溶液，浓度为50mmol/L。过滤去除细菌，4℃避光保存。

1.3 菌悬液制备 将菌株在沙氏葡萄糖琼脂培养基上连续转种2次，以保证其纯度和活力；经37℃培养48h的菌落，用无菌0.9%氯化钠溶液制成菌悬液；通过血球计数板计数，将菌悬液调制成（2～5）×105cfu/ml。

1.4 分组及光动力治疗 参照相关文献，实验组分为3组[5]：T1组为1mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液与中型无绿藻37℃避光孵育30min，T2组为5mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液与中型无绿藻37℃避光孵育30min，T3组为10mmol/L 5-氨基酮戊酸溶液与中型无绿藻37℃避光孵育30min，3个实验组均接受激光照射。对照组分为3组：C1组为不加5-氨基酮戊酸溶液的中型无绿藻37℃避光孵育30min后不接受照射，C2组为加5-氨基酮戊酸溶液的中型无绿藻37℃避光孵育30min后不接受照射，C3组为不加5-氨基酮戊酸溶液的中型无绿藻37℃避光孵育30min后接受照射。菌悬液调制成约1×105cfu/ml，置于24孔板中。参照相关文献，给予窄波LED（633±10）nm，LED-IB，武汉亚格光电技术有限公司），照射参数为100mW/cm2，距离为1cm，时间为20min[6]。

1.5 菌落计数法 实验组和对照组经上述处理后，每孔取10μl，用灭菌玻璃涂布棒均匀涂于沙氏葡萄糖琼脂培养基上，37℃温箱孵育，48～96h后待菌落形成明显时进行计数。所有实验每组重复3孔，实验重复3次。

1.6 统计学处理 应用Stata 14.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 中型无绿藻3个对照组菌落计数比较 7株中型无绿藻3个对照组菌落计数比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；经两两比较，C2组菌落计数均明显低于C1组、C3组（均P＜0.05）；提示C2组单纯使用5-氨基酮戊酸溶液且不照光的情况下，依然能在一定程度上抑制中型无绿藻的生长，见表1。

表1 中型无绿藻3个对照组菌落计数比较（×103cfu/ml）

2.2 中型无绿藻3个实验组菌落计数比较 3个实验组每株中型无绿藻生长均受到抑制，与C2组菌落计数比较差异均有统计学意义（均P＜0.05）。仅有3株中型无绿藻（O22a、O22c、O22d）3个实验组菌落计数比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05）；另4株中型无绿藻（O22b、O22e、O22f、O22g）3 个实验组菌落计数比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05），见表2。参考国外相关文献，笔者以C1组为参照，计算不同浓度5-氨基酮戊酸光动力处理后中型无绿藻菌生长总的受抑制率，结果为41.78%～87.82%，平均为（66.81±10.94）%。将5-氨基酮戊酸光动力处理后7株中型无绿藻生长总的受抑制率合并后进行统计分析，T1、T2和T3组中型无绿藻菌生长总的受抑制率分别为（59.09±10.27）%、（70.44±11.01）%和（70.90±7.12）%，差异有统计学意义（F=10.17，P＜0.05）；经两两比较，T2、T3组中型无绿藻生长受抑制率均明显高于T1组（均P＜0.05），T2与T3组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 不同5-氨基酮戊酸浓度光动力处理后中型无绿藻菌落计数的比较（×103cfu/ml）

3 讨论

目前国内外关于无绿藻病尤其是皮肤无绿藻病的报道逐渐增多[7-13]。虽然无绿藻病尚无公认有效的治疗方案，但主流方案依然是使用抗真菌药物。临床上无绿藻病治疗失败的现象很常见[3]。光动力抗感染化学疗法已被成功用于各种致病性真菌感染、难治性或复发性皮肤及皮下深部的真菌感染[5-6，14-15]。

笔者通过体外试验发现5-氨基酮戊酸光动力抗感染化学疗法能抑制中型无绿藻的生长，而单纯加5-氨基酮戊酸但不接受照射的C2组中型无绿藻的生长亦能被抑制，与国外关于致病真菌的研究结果一致[14]；笔者推测可能机制是5-氨基酮戊酸的酸性环境能抑制真菌及无绿藻的生长。与C2组比较，3个实验组中型无绿藻的生长均受到明显抑制，进一步证实5-氨基酮戊酸光动力治疗能抑制中型无绿藻的生长。以C1组为参照，经5-氨基酮戊酸光动力处理后中型无绿藻生长总的受抑制率为41.78%～87.82%，与国外临床资料显示的光动力治疗对致病真菌的50%～80%或更高的抑制率类似[16]。本研究结果显示，5-氨基酮戊酸浓度为1～5mmol/L时，光动力治疗抑制中型无绿藻的效应具有浓度依赖性，但超过5mmol/L后这一效应并不增强。以上体外研究结果均表明了5-氨基酮戊酸光动力治疗无绿藻病尤其是皮肤无绿藻病的可能性。最近有西班牙学者通过温热疗法联合抗真菌药物成功治疗无绿藻病[17]。相关研究表明光动力治疗不仅能直接抑制靶细胞的生长，还具有温热效应，进一步加强细胞毒性反应[18]。近期亦有学者发现光动力治疗能提高抗真菌药物的敏感性[11]，亦有研究发现光动力治疗与氟康唑联合使用能产生协同作用[19]，进一步表明了5-氨基酮戊酸光动力抗感染化学疗法辅助抗真菌药物用于临床皮肤无绿藻病的前景。

5-氨基酮戊酸光动力抗感染化学疗法抑制真菌的机制可能是5-氨基酮戊酸作为前体药物，在真核细胞内转化为原卟啉IX，在相应波长的光线照射下原卟啉IX产生单线态氧及其他自由基，从而杀伤真菌细胞。但这一疗法对中型无绿藻的具体抑菌机制及作用的靶细胞器有待进一步研究，对皮肤无绿藻病的有效性也有待进一步临床验证。