27-羟基胆甾醇诱导人神经母细胞瘤细胞凋亡的调控机制

朱梦娇 黄燕燕 曹立 唐维国

27-羟基胆甾醇（27-OHCH）是一种典型的胆固醇氧化代谢产物，能自由通过血脑屏障而进入脑内，从而影响脑中髓鞘形成及神经退行性疾病的发生[1-2]。痉挛性截瘫5型（SPG5A）的致病基因胆固醇7α羟化酶（CYP7B1）基因发生突变[3]，会引起神经中枢神经甾体代谢和肝内胆固醇旁路代谢异常，主要表现在肝脏对27-OHCH、在神经中枢对脱氢表雄酮（DHEA）进行羟化反应异常[4]。Schüle等[5]发现SPG5A患者血清中27-OHCH浓度是对照组的6～7倍，携带者与正常对照者差异无统计学意义；SPG5A患者脑脊液中27-OHCH浓度是对照组的30～50倍，但脑脊液中氧化型胆固醇等指标均正常。此外，动物实验研究表明，CYP7B1基因敲除的3月龄小鼠脑脊液中27-OHCH浓度明显高于野生型小鼠[6]。SPG5A患者和CYP7B1基因敲除小鼠脑脊液中27-OHCH浓度明显升高，提示27-OHCH浓度升高可能是SPG5A发病的重要因素。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT）信号通路是参与细胞生长、增殖及死亡调控的重要通路之一[7]。中度或不持续的AKT活化能抑制细胞凋亡，通过各种下游效应分子促进细胞生长和血管生成；相反，AKT的过度激活会引发细胞衰老和凋亡[8]。27-OHCH能促使神经细胞生成β-淀粉样蛋白明显增多[9-10]，上调Caspase-12，从而影响线粒体膜电位，使得活性氧自由基（ROS）蓄积，引起细胞凋亡[11-13]；但具体调控机制目前尚未阐明。本研究将AKT抑制剂LY294002作用于人神经母细胞瘤细胞（SH-SY5Y），封闭PI3K/AKT信号通路，观察27-OHCH的细胞毒效应是否受其影响，进而探索27-OHCH诱导细胞凋亡的机制，为进一步揭示SPG5A的发病机制提供新思路。

1 材料和方法

1.1 细胞来源及培养 SH-SY5Y细胞购于中国科学院上海细胞库。用含10%FBS的RPMI 1640培养基，置37℃、5%CO2孵育箱中传代培养。

1.2 试剂及仪器 27-OHCH（英国Tocris Bioscience公司），以无水乙醇作为溶剂配置成20mM母液，置-20℃保存备用；RPMI 1640培养基、含 FBS的 DMSO、ACCUTASETM细胞消化液（美国Gibco公司）；抑制剂LY294002、DAPI染液、CCK-8试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；0.45μm硝酸纤维素膜（美国Millipore公司）；Annexin V-PE/7-AAD试剂盒（美国BD Sciences公司）；AKT、磷酸化 AKT（p-AKT）、Caspase-9、β-actin 等抗体（美国Cell Signaling Technology公司）。FACS Calibur流式细胞仪（美国BD公司）。

1.3 CCK-8法检测细胞存活率 取5×104个/ml对数生长期细胞接种于96孔板，设置不同浓度（3.125、6.25、12.5、25.0、50.0μM）27-OHCH 处理组、溶剂对照组（添加与27-OHCH处理组相应浓度的无水乙醇）、空白组（孔内不加细胞，仅加细胞培养液）、阴性对照组（孔内加细胞，但不添加27-OHCH），每组6个复孔，分别作用24、48h后，吸去旧培养基；将培养基与CCK-8试剂按10∶1混匀，每孔加入100μl混合试剂；将培养板置于37℃、5%CO2恒温培养箱中避光孵育2h；利用酶标仪于450nm处测定吸光度（A）值。利用公式计算细胞存活率，细胞存活率=[（A27-OHCH处理组-A空白组）/（A溶剂对照组-A空白组）]×100%。

1.4 细胞形态观察 取1×105个/ml对数生长期细胞接种于φ14mm细胞爬片，次日加入不同药物浓度的27-OHCH。设置不同浓度的27-OHCH处理组，AKT通路抑制剂组（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同浓度的27-OHCH）、阴性对照组，其中27-OHCH的浓度为 12.5、25.0μM；作用 48h 后，甲醛固定 10min，DAPI染色，在荧光显微镜下观察细胞核形态。

1.5 Western blot法检测细胞内 p-AKT、cleaved-caspase-9蛋白表达 取1×105/ml对数生长期细胞接种于24孔板，设置27-OHCH处理组、AKT通路抑制组（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同浓度的27-OHCH）、空白对照组，其中27-OHCH的浓度为0、3.125、6.25、12.5、25.0、50.0μM。作用 48h 后用细胞裂解液裂解细胞，取蛋白样品约15μl，经12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜于0.45μm硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉封闭2h，一抗4℃过夜；TBST缓冲液洗膜3次，10min/次；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG二抗（1∶2 000）室温孵育1h；TBST缓冲液洗膜3次，10min/次；将膜置于ECL化学发光剂中，用X线胶片曝光、显影及定影；以β-actin作为内参，应用Quantity one软件计算各WB条带的灰度值。

1.6 Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡率 取1×105个/ml对数生长期细胞接种于24孔板，设置不同浓度的27-OHCH处理组、AKT通路抑制组（10μM LY294002提前作用2h，再加入不同浓度的27-OHCH）、无水乙醇溶剂对照组、无水乙醇+DMSO溶剂对照组，其中27-OHCH的浓度为12.5、25.0μM。利用ACCUTASETM细胞消化液消化细胞；800r/5min离心收集细胞，将细胞重悬于100μl结合液中；加入5μl Annexin V-PE和5μl 7-AAD，避光、室温孵育15min；FACS Calibur流式细胞仪上机检测，应用FlowJo软件分析细胞凋亡率。Annexin V-/7-AAD-为活细胞，Annexin V+/7-AAD-为早期凋亡细胞，Annexin V+/7-AAD+为晚期凋亡细胞或坏死细胞；其中Annexin V+/7-AAD-、Annexin V+/7-AAD+为凋亡细胞。

1.7 统计学处理 应用SPSS 18.0统计软件。计量资料用表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用Dunnet-t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 27-OHCH对SH-SY5Y细胞存活率的影响 给药24h，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 处理组 SH-SY5Y 细胞存活率均较阴性对照组明显降低，差异均有统计学意义（均 P＜0.05）；给药 48h，不同浓度（3.125～50.0μM）27-OHCH处理组SH-SY5Y细胞存活率均较阴性对照组明显降低，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。提示随着27-OHCH浓度增加或给药时间延长，SH-SY5Y细胞存活率均明显下降，见图1。

图1 27-OHCH对SH-SY5Y细胞存活率的影响（与阴性对照组比较，*P＜0.05）

2.2 AKT抑制剂逆转27-OHCH细胞毒效应的形态学观察 在光学显微镜下，12.5、25.0μM 27-OHCH处理组作用48h后，SH-SY5Y细胞数量较阴性对照组明显减少，细胞形态发生明显变化（细胞皱缩变圆，贴壁能力减弱），随着27-OHCH浓度增加，变化越明显。DAPI染色结果显示，12.5、25.0μM 27-OHCH处理组SH-SY5Y细胞核出现明显的凋亡现象（核内染色质不规则凝集，细胞核破碎成块状或半月状，凋亡小体出现），随着27-OHCH浓度增加，凋亡现象越明显。与相同浓度的27-OHCH处理组比较，在光学显微镜下AKT通路抑制组SH-SY5Y细胞数量增多，细胞形态较好；在荧光显微镜下细胞核凋亡现象有所减弱，见图2。

图2 AKT抑制剂逆转27-OHCH细胞毒效应的形态学观察[a：阴性对照组；b：27-OHCH（12.5μM）处理组；c：27-OHCH（25.0μM）处理组；d：LY294002（10μM）+27-OHCH（12.5μM）组；e：LY294002（10μM）+27-OHCH（25.0μM）组]

2.3 27-OHCH对SH-SY5Y细胞内p-AKT、cleavedcaspase-9蛋白表达的影响 随着27-OHCH处理组浓度的增加，SH-SY5Y细胞内p-AKT（Ser 473）表达逐渐增强，见图 3a；经定量分析，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH处理组SH-SY5Y细胞内p-AKT（Ser 473）表达水平较阴性对照组均明显升高（均P＜0.05），见图4。12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 处理组 SH-SY5Y 细胞内cleaved-caspase-9（37/35kD）表达明显增强，见图 3b。经AKT抑制剂预作用后，不同浓度（0～50.0μM）27-OHCH处理组p-AKT（Ser 473）表达均受抑制，见图3c；而12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH 处理组 cleaved-caspase-9蛋白表达变化不明显，见图3d。提示27-OHCH能引起SHSY5Y细胞凋亡，AKT通路可能在其中发挥作用。

图3 27-OHCH对SH-SY5Y细胞内p-AKT、cleaved-caspase-9蛋白表达的电泳图

图4 不同浓度27-OHCH处理组SH-SY5Y细胞内p-AKT（Ser 473）表达水平（与阴性对照组比较，*P＜0.05）

2.4 AKT抑制剂逆转27-OHCH细胞凋亡诱导的作用给药48h，12.5、25.0μM 27-OHCH处理组均能引起SHSY5Y细胞凋亡效应，细胞凋亡率分别为（24.04±0.83）%和（42.95±3.89）%，均高于无水乙醇溶剂对照组的（9.44±0.32）%（均 P＜0.05）。AKT 抑制剂预作用 2h能逆转细胞凋亡效应，LY294002（10μM）+27-OHCH（12.5μM）组细胞凋亡率为（16.03±0.39）%，明显低于 12.5μM 27-OHCH 处理组（P＜0.05）；LY294002（10μM）+27-OHCH（25.0μM）组细胞凋亡率为（22.77±1.83）%，明显高于无水乙醇+DMSO 溶剂对照组的（11.05±0.61）%（P＜0.05），但明显低于 25.0μM 27-OHCH 处理组（P＜0.05），见图5。提示AKT抑制剂能逆转27-OHCH对SH-SY5Y细胞凋亡的诱导作用。

图5 Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡情况

3 讨论

27-OHCH是外周细胞内胆固醇侧链被氧化的主要羟固醇产物之一，可通过血脑屏障入脑。研究发现SPG5A患者脑脊液中的27-OHCH浓度明显升高，经无胆固醇饮食或长期鹅去氧胆治疗，可能降低神经甾体的浓度，从而改善或稳定SPG5A患者症状[5，14]。相关研究发现，阿尔茨海默病（AD）患者大脑27-OHCH浓度较正常对照组急剧升高[15]。血浆胆固醇水平升高能使羟固醇入脑增多，影响神经细胞的正常结构及功能，进而引起β-淀粉样蛋白增多，进一步影响AD的发生、发展[16-17]。可见，27-OHCH浓度异常与中枢系统神经退行性疾病可能有关[3-4]。Prasanthi等[10]发现27-OHCH作用于SH-SY5Y细胞后，该细胞表达增强，与AD发病机制相关蛋白如β-淀粉样蛋白、磷酸化Tau蛋白水平亦明显升高。此外，研究表明27-OHCH作用于SH-SY5Y细胞后，α-突触核蛋白水平明显升高，从而引起ROS蓄积、炎症损伤、细胞凋亡[11-13]。本研究结果发现，27-OHCH能诱导 SH-SY5Y 细胞凋亡，给药 24h，12.5、25.0、50.0μM 27-OHCH处理组细胞存活率均明显降低；给药48h，各药物浓度均可导致SH-SY5Y细胞存活率降低。荧光显微镜下细胞形态学观察与Annexin V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测发现，12.5、25.0μM 27-OHCH处理组能诱导SH-SY5Y细胞凋亡，使细胞数量减少。目前尚无研究涉及27-OHCH的调控机制，因此，笔者就27-OHCH诱导SH-SY5Y细胞毒效应的信号通路作一研究。

PI3K/AKT信号通路是细胞生存的重要信号通路之一，它在细胞增殖、分化及死亡等方面起着重要作用。AKT是PI3K下游的效应分子，PI3K结合AKT的PH结构域能使AKT从细胞质向细胞膜转位，并改变其构象，使得AKT Thr 308或Ser 473位点发生磷酸化，从抑制状态变为激活状态[12]。中度或不持续的AKT活化能抑制细胞凋亡，通过各种下游效应分子促进细胞生长和血管生成[18-19]。然而，AKT的过度激活会引发细胞衰老和凋亡，主要机制是通过增加胞内ROS产量，抑制FoxO转录因子并下调其下游抗氧化酶MnSOD、过氧化氢酶等表达[8]。Nogueira等[20]发现细胞AKT的活化程度越高，对ROS诱导的凋亡效应越灵敏。更有以此为基础，通过雷帕霉素过度激活癌细胞AKT活化水平，达到消除肿瘤细胞的目的[21]。本研究发现浓度递增的27-OHCH（3.125～50.0μM）作用于 SH-SY5Y 细胞，随着细胞内AKT活化水平的增加，细胞凋亡程度明显增强，推测27-OHCH诱导的细胞凋亡效应与AKT过度活化相关。此外，显微镜下观察、Western blot和流式细胞仪检测结果均表明AKT通路抑制剂LY294002能逆转27-OHCH诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。

综上所述，27-OHCH通过PI3K/AKT信号通路诱导细胞毒效应。本研究对该调控通路的探讨，为最终揭开27-OHCH相关神经退行性疾病病因、寻找有效的临床治疗方法及靶点提供了新方向。