马尾松根际溶磷菌的筛选及鉴定

2018-09-28宋贤冲唐健

长江大学学报(自科版) 2018年18期

关键词：溶磷磷素马尾松

宋贤冲，唐健

(广西壮族自治区林业科学研究院，广西南宁 530002；广西优良用材林资源培育重点实验室，广西南宁 530002；国家林业局中南速生材繁育实验室，广西南宁 530002)

金辉，吴雪

(广西壮族自治区产品质量检验研究院, 广西南宁 530007)

邓小军,覃其云,石媛媛

磷是林木生长必不可少的大量元素之一，然而在我国南方尤其是广西，由于土壤中的固定作用强烈，导致土壤中有效磷缺乏[1]。为了提高林木的生产力，林木施肥日益受到林业生产者的重视，但大量投入的磷肥仅有一小部分被林木吸收利用，绝大多数磷迅速转化成难溶性的磷存在于土壤中，或是被雨水冲刷进入水体中[2]。因此，研发土壤磷素利用效率的高效微生物磷肥十分迫切。

马尾松(PinusmassonianaLamb.)是广西主要的用材林树种之一，同时也是我国主要的松脂生产树种[3]。研究表明，不同种源和家系的马尾松吸收和利用土壤磷素能力存在显著差异，磷素缺乏对马尾松根系构型和生长有显著的影响[4，5]，磷素是影响马尾松生长的主要因子[6]。根际是植物与土壤进行物质交换最活跃的界面，有研究表明根际土壤解磷微生物数量比非根际高1～2个数量级[7]。因此，本研究对广西马尾松根际土壤溶磷菌进行了分离筛选，以期筛选出高效的溶磷菌株，为进一步研制微生物磷肥提供基础资料和科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

马尾松根际土壤样品采集自广西主要马尾松种植区，包括宁明广西国有派阳山林场、梧州和田林等地。在树木周围多点挖取0～20cm土层内的根系，先将大块不含根系的土壤抖落，然后取近根系表面的细粒土壤，装入无菌自封袋内混匀，作为根际土壤。所有试剂均为分析纯或化学纯。

溶磷菌筛选培养基采用NBRIP培养基，制作方法参考文献[8]。细菌分离、纯化和培养采用营养琼脂和LB培养基，分别购买自广东环凯微生物科技有限公司和北京索莱宝科技有限公司。溶磷效果测定采用PVK(Pikovskaya)液体培养基，制作方法参考文献[9]。

1.2 方法

1.2.1 溶磷菌的筛选与分离

称取10g土样溶于90mL无菌水中，用10倍稀释法分别配制10-3、10-4g/mL的土壤悬液，分别涂布到分离培养基上，35℃倒置培养3d，观察出现溶磷圈的菌落，测定溶磷圈直径(D)、菌落直径(d)，根据能否产生溶磷圈与D/d值大小来初步确定菌株的溶磷能力。挑选D/d值≥1.5的菌株，利用平板划线纯化的方法，将菌株进行分离纯化。4℃下保存于营养琼脂斜面，-20℃下保存菌种于甘油管中。

1.2.2 溶磷菌溶磷效果的测定

将分离纯化获得的细菌挑取一环，接种到LB培养基中，取生长在对数期的菌液，以1%(v/v)的接种量接入到PVK培养基中，35℃、180r/min恒温摇床震荡培养3d。取发酵液5mL 4000r/min离心3min，取上清液测定有效磷含量和pH。设不接菌为对照，每个处理重复3次。

用pHS-3C型酸度计测定发酵液的pH；取发酵上清液稀释适当倍数，利用731型紫外可见分光光度计在700nm波长处通过钼锑抗比色法[10]测定光密度值并计算有效磷含量，溶磷量为接种菌液扣除对照的有效磷含量；数据采用Excel预处理后，用SPSS 17.0进行统计分析。

1.2.3 溶磷菌的分子生物学鉴定

细菌总DNA提取采用天根生化科技(北京)有限公司的细菌基因组DNA提取试剂盒，具体操作按照试剂盒说明书进行。

以提取的细菌DNA为模板，采用通用引物27F和1492R进行16S rDNA的PCR扩增，扩增反应在Biometra EasyCycler Gradient PCR仪上进行。PCR反应体系50μL，其体系为2×Es Taq MasterMix 25μL，27F(10μmol/L)1μL，1492R(10μmol/L)1μL，DNA模板1μL，双蒸水22μL。PCR扩增程序为：94℃预变性2min；94℃变性0.5min，56℃退火0.5min，72℃延伸1min，35个循环；72℃终延伸2min。

用1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，产物和Marker上样量均为3μL，电泳结果于上海天能5200Multi全自动化学发光/荧光图像分析系统成像。PCR产物经试剂盒纯化后送至南宁国拓生物科技有限公司进行测序，测序结果在NCBI上进行Blast比对，并通过软件Clustal X 1.83和MEGA 4.0构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株分离结果

从马尾松根际分离获得1株溶磷菌株，标记为DP07。

2.2 溶磷菌的溶磷效果

表1 液体摇瓶培养条件下的溶解效果

将分离到的菌株，接种到PVK液体培养基中进行液体发酵试验，摇瓶培养3d后测得发酵液中的有效磷含量和pH变化(表1)。

由表1可知，菌株DP07在培养3d后，对5.0g/L的磷酸三钙溶液的溶磷量达到(3.599±0.24)mg/L，是对照(CK)的3倍。摇瓶培养3d后，对照处理和接种菌株处理培养液的pH均有一定程度的下降，接种菌株处理比对照(CK)的pH低近1个单位。

图1 DP07在NBRIP培养基上的菌落和菌体(1000×)

2.3 菌体形态

分离到的菌株DP07在NBRIP培养基上培养3d后的形态、透明圈和革兰氏染色结果见图1。由图1可知，菌株DP07为短杆状，革兰氏染色阴性，具运动性。

2.4 分子生物学鉴定

利用通用引物，对溶磷菌株DP07的16S rDNA基因片段进行PCR扩增，得到长度约为1500bp的扩增产物。将其在NCBI网站的blatn数据库中进行在线blast比对分析，结果发现菌株DP07与Burkholderiaphenaziniumstrain A1(Genbank登录号：NR_029212.1)的序列相似度达到99%。根据比对结果进行菌株DP07的系统发育分析如图2所示。