丹皮酚GC-MS测定方法的建立及应用

易承学，曹 杰，徐 虹，徐希明，余江南

0 引言

丹皮酚(Paeonol)又称牡丹酚，是从毛茛科芍药属植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.、芍药P.lactifloraPall.的根皮和萝摩科植物徐长卿Cynanchumpaniculatum(Bunge) Kitag.的干燥根或全草中提取出的有效成分[1]，化学名为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，结构式见图1。研究表明，丹皮酚在抗菌消炎、解热镇痛、调节免疫、抗肿瘤、抗氧化及抗过敏等方面均呈现出良好的药理活性[2-3]，开发前景广阔，临床上有丹皮酚软膏，丹皮酚(磺酸钠)注射剂和丹皮酚片等制剂，多用于心脑血管、肿瘤、炎症、变态反应及免疫系统等疾病[4]。但该药存在易挥发、水溶性差、体内半衰期短及生物利用度低等不足，近年来围绕其新剂型的研究日趋活跃[5-8]。

有关丹皮酚的测定方法中较常见的有紫外分光光度法、毛细管电泳、高效液相色谱法和气相色谱法[9]。气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)既具备气相色谱的高效在线分离能力，又发挥了质谱的高选择性、高灵敏度检测能力，专属性强，检测限低，是组分复杂及微量样品分离分析最有力的研究手段，在药物分析领域已有广泛的应用[10-11]。药物的溶解度是影响药物在生物体内吸收程度和速度的重要因素之一，亦是制剂研究的重要参数，测定药物在不同介质中的溶解度有助于指导其剂型的合理设计。本实验采用GC-MS，以联苯为内标，建立了丹皮酚的含量分析方法，并研究该药在15种常用有机溶剂中的平衡溶解度，旨在为进一步设计和开发出丹皮酚新剂型提供有益参考。

图1 丹皮酚化学结构式

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 7890A-5975C型气质联用仪(美国安捷伦公司)，XPE205电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，ROTINA 380R离心机(德国Hettich公司)，THZ-300型恒温摇床(上海一恒科技有限公司)；KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 试剂 对照品丹皮酚(纯度99.2%，批号：C1610281)、内标正十五烷(纯度99.8%，批号：F1508060)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，内标联苯(纯度99.99%，批号：G124924)购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。丹皮酚原料自制。大豆油和精制玉米油由江西益普生药业有限公司提供，中链甘油三酸酯由铁岭北亚药用油有限公司提供，正丁酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、油酸乙酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、异丙醇、乙醇、乙二醇、聚乙二醇200和聚乙二醇400均由国药集团化学试剂有限公司提供，聚氧乙烯蓖麻油和聚氧乙烯氢化蓖麻油由德国BASF公司提供。石油醚(35～60 ℃)由美国Tedia公司生产。

2 方法与结果

2.1 丹皮酚GC-MS测定方法

2.1.1 分析条件 色谱条件：DB-5MS毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，进样口温度220 ℃，载气为高纯氦气，流速1 ml/min，柱温采用程序升温，初始温度50 ℃，以20 ℃/min升至220 ℃，分流比为10∶1，进样体积为1.0 μl。

质谱条件：气质接口温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，四级杆温度为150 ℃，电子轰击源(EI)电离方式，电子能量为70 eV，溶剂延迟5 min。选择离子检测模式(SIM)，丹皮酚的选择离子166、151、108，定量分析离子151。联苯的选择离子154、153、152、76，定量分析离子154。

2.1.2 溶液的配制 内标溶液：精密称取联苯适量，石油醚溶解，配成2.02 mg/ml的内标溶液，置于-20 ℃保存备用。对照品溶液：精密称取丹皮酚适量，用石油醚溶解后定容，制成5.02 mg/ml溶液，作为对照品储备液。精密吸取该储备液0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 ml于5 ml容量瓶中，各精密加入0.25 ml内标液，石油醚稀释至刻度，制成系列质量浓度对照品溶液。供试品溶液：称取丹皮酚原料50 mg，置10 ml容量瓶中，加石油醚溶解并稀释至刻度，摇匀。精密吸取该溶液0.1 ml，置5 ml容量瓶中，精密加入0.25 ml内标溶液，石油醚定容至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 方法学考察 系统适用性考察：取对照品溶液与供试品溶液1 μl注入气质联用仪，按照“2.1.1”项条件进行分析，丹皮酚和联苯分离良好，样品测定无干扰。丹皮酚和联苯的保留时间分别为7.411 min和7.035 min，质谱图见图2。从图2可以看出，m/z166、151、108和m/z154、153、152、76分别为二者的主要碎片离子峰，相对丰度高，且无干扰。

图2 丹皮酚(A)、联苯(B)的GC-MS质谱图

线性关系考察：取上述系列质量浓度对照品溶液各1 μl进样分析，每种浓度的待测液连续进样2次。以对照品与内标物质量浓度之比(x)为横坐标，二者峰面积之比的2次平均值(y)为纵坐标，进行线性回归分析，得回归方程为：y=0.786 5x-0.072，r=0.999 5，表明丹皮酚在25.1～401.6 μg/ml范围内线性关系良好。

精密度试验:取同一对照品溶液，按照“2.1.1”项分析条件连续进样6次，计算峰面积的RSD，考察方法的精密度。结果丹皮酚与联苯峰面积比值的RSD为1.6%，表明本方法精密度好。

稳定性试验:将供试品溶液置棕色瓶中于25 ℃下放置，分别于0、2、4、8、12、24 h时取样1 μl测定，计算丹皮酚含量，考察样品的稳定性，RSD为2.4%，表明24 h内供试品的石油醚溶液基本稳定。

重复性试验:取同一批丹皮酚原料适量，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，照“2.1.1”项分析条件进样测定，内标法计算其含量。结果样品中丹皮酚平均含量为86.7%，RSD为1.8%，说明该方法重复性好。

加标回收试验:取已测知含量的同一批丹皮酚原料适量，按“2.1.2”项下供试品溶液浓度的80%、100%、120%分别配制低、中、高3种浓度的溶液各3份，作为供试溶液。照“2.1.1”项下分析条件测定并计算回收率。低、中、高3种质量浓度的平均回收率分别为97.0%、99.7%、102.3%(n=3)，RSD分别为2.3%、1.9%、2.5%(n=3)，表明该方法的准确度较高，符合含量测定的要求。

2.1.4 样品含量测定 取3批丹皮酚原料，精密称量后按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测定含量。结果3批样品的含量分别为86.7%、87.2%和87.9%。

2.2 丹皮酚平衡溶解度测定

2.2.1 溶解平衡时间考察 称取丹皮酚约3 g至100 ml具塞三角瓶中，加入10 g大豆油后密封，置恒温摇床中，25 ℃下100 r/min振摇，于1、2、4、6、8、12 h时间点取1 g溶液后，补足溶剂，在恒温条件下经0.45 μm微孔滤膜过滤，精密移取50 mg续滤液至10 ml容量瓶中，添加0.5 ml内标溶液，然后用石油醚定容，GC-MS法测定，并以振摇时间(h)对丹皮酚浓度(mg/g)作图，得丹皮酚在大豆油中的溶解平衡曲线(见图3)。既往研究表明，丹皮酚在蒸馏水中振摇72 h方能达到溶解平衡[12]，本实验发现其在大豆油中振摇4 h即可实现。这是由于丹皮酚是一种疏水性的小分子酚类化合物，易溶于有机溶剂，因而明显缩短了溶解平衡时间。

图3 丹皮酚在大豆油中振摇溶解平衡曲线

2.2.2 平衡溶解度测定 试验中选择15种溶剂：乙醇、异丙醇、乙二醇、聚乙二醇200、聚乙二醇400、聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油、大豆油、精制玉米油、肉豆蔻酸异丙酯、中链甘油三酸酯、正丁酸乙酯、油酸乙酯。取过量丹皮酚置10 ml具塞试管中，分别加入5 g上述溶剂，超声30 min，于25 ℃下100 r/min振摇24 h，取出离心(6 000 r/min,10 min)，吸取各上清饱和溶液，0.45 μm微孔滤膜滤过，精密称取适量续滤液至10 ml容量瓶中，石油醚稀释至线性范围内，加入0.5 ml内标溶液，定容后摇匀，取1 μl注入气质联用仪进行测定，代入标准曲线中计算丹皮酚在各溶剂中的平衡溶解度。据参考文献，丹皮酚在水中的溶解度仅为0.386 mg/ml，属于“几乎不溶或不溶”范畴[12]，但本实验结果显示其在有机溶剂中的溶解度显著增大，其中在正丁酸乙酯中最大，为376.8 mg/g，在乙二醇中最小，为21.5 mg/g。见表1。

3 讨论

GC-MS含量测定采用内标法较为准确，而选择合适的内标物很重要。本实验对2种内标物联苯和正十五烷在所选色谱柱上的保留时间和响应值进行了考察，结果显示,二者的保留时间分别为7.035 min和7.689 min，出峰时间均适中，但联苯的响应值要高于正十五烷，且价廉易得，故以其作为内标物。

表1 丹皮酚在25 ℃不同溶剂中的平衡溶解度(n=3)

徐本亮等[13]采用高效液相色谱法测定了丹皮酚在水、磷酸盐缓冲液及甲醇等常用有机溶剂中的平衡溶解度，本次实验就丹皮酚在表面活性剂、助表面活性剂、油相中的平衡溶解度进行了测定。鉴于丹皮酚的水溶性差，提示其普通固体制剂将在胃肠道表现出溶出速率缓慢，导致吸收差，生物利用度低下。因此，在设计新剂型时，可考虑通过制备脂质体、纳米乳、纳米囊和纳米球等纳米制剂，以及固体分散技术、包合技术等制剂新技术来提高其溶解度，进而改善生物利用度。本实验结果显示，丹皮酚在文中所列出的几种表面活性剂、助表面活性剂和油相中的平衡溶解度均较大，其中在正丁酸乙酯中最大，油酸乙酯次之，这可以为制剂配伍辅料的选择提供依据。