葛根素对重度烧伤后肺组织损伤保护作用的研究

赵轶君

0 引言

重度烧伤不仅损害皮肤和皮下组织，还可诱发多组织器官并发症，其中肺组织损伤是最常见的并发症，也是导致重度烧伤患者死亡的主要原因之一[1]。既往研究发现,氧化应激损伤、炎症反应及肺组织细胞凋亡是严重烧伤后肺组织损伤并发症发生发展的重要病理机制[1-4]。葛根素是中药葛根的主要有效成分之一，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种生物学活性[5-6]，但葛根素对重度烧伤后肺组织损伤是否具有保护作用的文献报道尚不多见，本研究针对这一问题进行实验研究。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 葛根素购自湖南金农生物资源股份有限公司(纯度≥98%，批号：20161229)；乳酸钠林格注射液(吉林科伦康乃尔制药有限公司，批号：170108004)；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、髓过氧化物酶(MPO)、MDA测定试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司，批号：170325、170116、170407、161130)；肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6、IL-8、IL-10、酶联免疫(ELISA)试剂盒(碧云天生物技术有限公司，20170124、20170108、20161230、20161225)。

1.2 实验动物 SPF级雄性SD大鼠(鼠龄7周，体重210～250 g)购自浙江省实验动物中心[许可证号：SCXK(浙)2013-0033]。

1.3 实验方法

1.3.1 分组、模型制备与给药 取180只实验用大鼠，按照随机数字表法随机分为假烧伤组，模型组，葛根素低(50 mg/kg)、中(100 mg/kg)、高(200 mg/kg)剂量组和地塞米松5 mg/kg组(地塞米松组)[7]，各30只。经脱毛处理后，采用92 ℃水浴18 s的方法，制备30% TBSA Ⅲ度烧伤大鼠模型[8]，经大体观察和皮肤病理切片证实，见图1、图2；假烧伤组大鼠经脱毛处理后，置37 ℃恒温水浴18 s。造模后，各组大鼠立即腹腔注射乳酸林格液(40 mg/kg)进行复苏处理，同时腹腔注射给药(模型组和假烧伤组给予生理盐水)，24 h后行各指标检测。

1.3.2 肺组织W/D测定 各组随机取10只大鼠，麻醉后开胸取肺组织，生理盐水冲洗、滤纸吸干后称重(W)；置烘干箱(60 ℃，24 h)称重(D)，计算肺组织W/D。

1.3.3 HE染色法行肺组织病理学检查并行肺泡炎程度评分(Szapiel评分) 各组随机取10只大鼠，麻醉后开胸取肺组织，置多聚甲醛溶液(浓度4%)72 h进行固定后进行石蜡包埋和切片，然后进行HE染色：脱蜡水化、染色、复染、脱水、封片等，通过倒置光学显微镜进行肺组织病理学检查。参照Szapiel等[9]报道的评分标准进行肺泡炎程度评分。0分：无肺泡炎；1分：轻度肺泡炎，受累面积小于全肺20%，肺泡结构正常；2分：中度肺泡炎，受累面积20%～50%，近胸膜部较重；3分：重度肺泡炎，受累面积超过50%，偶见肺泡腔内有单核细胞。每只大鼠取5张切片，每张切片取互不重叠的5个视野进行观察和评定，取平均值。

1.3.4 透射电镜观察肺组织超微结构 取1 mm×1 mm×1 mm肺组织，置2.5%戊二醛溶液中固定6 h后，置1%锇酸中进行后固定1 h，梯度乙醇脱水、环氧树脂包埋、切片(厚度约70 nm)、醋酸铀浸泡、枸橼酸铅染色、冲洗、干燥处理后，通过透射电子显微镜观察肺组织超微结构。

图1 大鼠大体照片

图2 皮肤病理切片照片(HE染色)

1.3.5 TUNEL染色法观察细胞凋亡状况及AI计算 取“1.3.3”项制备的肺组织石蜡切片，脱蜡水化后，应用TUNEL试剂盒进行操作处理，通过倒置光学显微镜观察肺组织细胞凋亡状况(细胞核黄染为阳性着色)；AI计算：显微镜下计数视野内凋亡细胞数和细胞总数，AI(%)=(凋亡细胞数/细胞总数)×100%，每只大鼠取5张切片，每张切片取互不重叠的5个视野进行观察和计算，取平均值。

1.3.6 肺组织中抗氧化酶、MPO活性和MDA含量的测定 取各组10只大鼠，麻醉后开胸取肺组织，冷生理盐水冲洗，加入适量冷生理盐水制备浓度为10%的组织匀浆液，离心(3 000 r/min，10 min)取上清液，按照各试剂盒操作方法步骤，通过紫外分光光度计测定肺组织中抗氧化酶(SOD、CAT)、MPO活性和MDA含量。

1.3.7 ELISA法检测血清中炎症细胞因子含量 于“1.3.6”项取肺组织前，开腹经腹主动脉取血并离心(1 500 r/min，5 min)取血清，参照ELISA试剂盒操作方法步骤(包被、加样、加酶标抗体、加底物液显色、终止反应等)依次处理后，通过酶标仪测定血清中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-10含量。

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织W/D比较 与假烧伤组比较，模型组大鼠肺组织W/D显著升高(P<0.01)；与模型组比较，葛根素中、高剂量组和地塞米松组W/D均显著降低(P<0.05或P<0.01)。葛根素高剂量组W/D与地塞米松组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 各组大鼠肺组织病理学检查结果及肺泡炎程度评分(Szapiel评分)比较 假烧伤组大鼠肺组织形态结构和肺组织细胞均未见异常；模型组大鼠肺组织呈现肺泡壁变厚，肺泡结构紊乱，肺泡内有液体渗出、炎症细胞浸润等病理性改变；与模型组比较，葛根素各剂量组和地塞米松组肺组织病变呈不同程度好转，以葛根素高剂量组效果最为显著。见图3。与假烧伤组比较，模型组大鼠Szapiel评分显著升高(P<0.01)；与模型组比较，葛根素中、高剂量组和地塞米松组Szapiel评分均显著降低(P<0.05或P<0.01)；葛根素高剂量组Szapiel评分与地塞米松组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

图3 各组大鼠肺组织形态结构(HE，200×)

组别只数W/DSzapiel评分假烧伤组105.09±0.210.37±0.14模型组106.53±0.54∗∗2.15±0.16∗∗葛根素低剂量组106.18±0.492.01±0.19葛根素中剂量组105.97±0.43△1.78±0.18△葛根素高剂量组105.52±0.29△△1.52±0.12△地塞米松组105.91±0.42△1.74±0.15△

注：与假烧伤组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01

2.3 各组大鼠肺组织超微结构检查结果 如图4所示，通过透射电子显微镜观察发现，假烧伤组大鼠肺组织肺泡上皮细胞细胞膜完整，细胞核完整、边界清晰，细胞核周围存在少量板层小体；模型组大鼠肺组织肺泡上皮细胞明显肿胀、细胞膜破坏、轮廓不清，细胞核周围板层小体数量明显增多；与模型组比较，经葛根素各剂量或地塞米松干预能够明显改善大鼠严重烧伤后肺组织超微结构病变，以葛根素高剂量组效果最为显著。

2.4 各组大鼠肺组织细胞凋亡状况及AI比较 如图5所示，与假烧伤组比较，模型组大鼠肺组织凋亡细胞数量增多；与模型组比较，经葛根素各剂量或地塞米松干预后，凋亡细胞数量呈减少趋势，以葛根素高剂量组最为显著。假烧伤组AI为2.49%±1.51%，模型组AI为63.84%±8.65%，葛根素低、中、高剂量组AI分别为56.17%±9.06%、46.75%±6.58%、31.07%±4.90%，地塞米松组AI为42.98%±4.35%；与假烧伤组比较，模型组AI显著升高(P<0.01)；而与模型组比较，葛根素中、高剂量组和地塞米松组AI显著降低(P<0.01)；与地塞米松组比较，葛根素高剂量组AI显著降低(P<0.05)。

图4 各组大鼠肺组织超微结构(透射电镜)

2.5 各组大鼠肺组织中抗氧化酶、MPO活性和MDA含量比较 与假烧伤组比较，模型组肺组织抗氧化酶(SOD、CAT)、MPO活性显著降低，而MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，葛根素中、高剂量组SOD、CAT活性显著升高，而MDA含量显著降低(P<0.05或P<0.01)，葛根素高剂量组MPO活性显著升高(P<0.01)，地塞米松组SOD活性显著升高，而MDA含量显著降低(P<0.05)；与地塞米松组比较，葛根素高剂量组SOD、CAT活性显著升高(P<0.05)，MPO活性和MDA含量两组间差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.6 各组大鼠血清中炎症细胞因子含量比较 与假烧伤组比较，模型组大鼠血清中炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8含量升高而IL-10显著降低(P<0.01)；与模型组比较，葛根素中、高剂量组和地塞米松组TNF-α、IL-6、IL-8含量显著降低而IL-10含量显著升高(P<0.05或P<0.01)；与地塞米松组比较，葛根素高剂量组TNF-α含量显著降低，两组间IL-6、IL-8、IL-10含量比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

图5 各组大鼠肺组织细胞凋亡状况(TUNEL，200×)

组别只数SOD(U/mg)CAT(U/mg)MPO(U/g)MDA(nmol/mg)假烧伤组1075.81±9.6434.13±5.861.92±0.342.31±0.49模型组1047.92±8.57∗∗18.67±4.90∗∗0.97±0.25∗∗5.72±1.27∗∗葛根素低剂量组1055.03±8.1222.84±5.761.08±0.325.06±1.15葛根素中剂量组1063.25±8.40△25.78±5.99△1.15±0.394.33±0.79△葛根素高剂量组1068.17±8.95△△#29.35±6.81△△1.24±0.35△2.94±0.81△△#地塞米松组1059.04±8.26△23.62±6.091.07±0.294.89±0.94△

注：与假烧伤组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与地塞米松组比较，#P<0.05

表3 各组大鼠血清中炎症细胞因子含量比较

注：与假烧伤组比较，**P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与地塞米松组比较，#P<0.05

3 讨论

肺组织损伤是常见的烧伤并发症，也是导致烧伤患者死亡的重要原因之一，其病理机制非常复杂，其中氧化应激损伤、炎症反应、细胞凋亡在烧伤所致肺组织损伤的发生发展中发挥着重要作用[1-4]。葛根为豆科植物野葛的干燥根，是我国传统中药品种，始载于《神农本草经》，味甘、辛、凉，具有解肌退热、透疹、生津止渴、升阳止泻之功效。葛根素是中药葛根的主要有效成分之一，近代药理学研究发现，葛根素具有抗氧化、抗炎、抗凋亡等多种药理学作用[5-6]。本实验研究发现，经葛根素100～200 mg/kg治疗能够有效抑制重度烧伤大鼠肺组织水肿，抑制肺组织形态结构病理性改变、肺泡炎病变和肺组织细胞凋亡，抑制肺组织超微结构病理性改变，提示葛根素对大鼠重度烧伤肺组织损伤具有一定的保护作用。

正常生理状态下，体内氧自由基(ROS)能够在超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)的逐步催化作用下被还原[10-11]，从而维持体内ROS动态平衡；若ROS生成与清除动态失衡，将攻击细胞膜而生成MDA[12]。髓过氧化物酶(MPO)主要存在于中性粒细胞，能够清除NO等而具有抑制氧化应激损伤作用[13]。本实验研究发现，经葛根素100～200 mg/kg治疗，能够有效升高肺组织SOD、CAT、MPO活性且降低MDA含量，提示葛根素对大鼠重度烧伤后肺组织氧化应激损伤具有一定的抑制作用。

TNF-α是在内毒素、炎症介质等细胞因子的作用下分泌产生的一种多肽化合物，TNF-α能够激活核因子NF-κB，从而介导其他炎症相关细胞因子IL-6、IL-8的合成与释放，启动炎症级联反应。此外，TNF-α还能够激活凝血系统和补体系统，从而诱导烧伤后肺组织损伤并发症的发生，在烧伤所致肺组织损伤的发病过程中发挥着重要作用[14]。IL-6、IL-8在急性期炎症反应中具有促进作用[15]，而IL-10具有抑制炎症反应的生理学作用[16]。本研究发现，葛根素100～200 mg/kg治疗能够显著降低炎症细胞因子TNF-α、IL-6、IL-8含量并提高IL-10含量，提示葛根素对大鼠重度烧伤后肺组织炎症反应具有一定的抑制作用。

综上所述，葛根素对大鼠重度烧伤后肺组织损伤具有一定的保护作用，其机制可能与葛根素能够降低氧化应激损伤、抑制炎症反应有关。