实时无标记细胞分析系统与台盼蓝染色法分析双酚A对小鼠睾丸间质细胞毒性作用的比较

马 林，罗家权，李 丹，张 康，张玉敏，裴秀丛，段志文，马明月

0 引言

双酚A(Bisphenol A，BPA)是一种环境内分泌干扰物，其作为增塑剂广泛应用于水瓶、塑料袋、食品包装袋等生活用品中。据统计，每年BPA的产量在390万吨左右[1]。研究显示，BPA存在于水体、土壤、空气及生物体内[2]。由于BPA的化学结构与雌激素类似，也被称为类雌激素样物质，因此，BPA对动物胚胎发育、生殖系统的损伤作用被广泛关注。

实时无标记细胞状态分析系统(Real-time cell analysis,RTCA)是一种通过专用接种板下微金电子传感器芯片，当贴壁生长在微电极表面的细胞引起电极界面阻抗的改变时，该阻抗值的变化直接反映细胞的生物学状态。因此，RTCA在细胞生理状态下可以实时、连续、定量跟踪细胞形态和增殖分化改变，为细胞水平的分析研究提供了一个实时动态信息获取的独特方法[3-4]。本文结合RTCA iCELLigence系统与台盼蓝染色法对BPA引起的小鼠睾丸间质细胞(TM3)的细胞毒性进行监测，通过对比研究细胞毒性的最佳实验手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 小鼠睾丸间质细胞(TM3)购自中国科学院细胞库。

1.1.2 仪器和试剂 CO2培养箱(美国Thermo公司)、超净工作台(中国东联哈尔仪器制造有限公司)、倒置显微镜(中国北京新惠泽奥科技有限公司)、台式离心机(美国Thermo公司)、RTCA iCELLigence(中国艾森生物有限公司)、Vi-cell细胞活力计数仪(美国贝克曼库尔克有限公司)。BPA(纯度：99%，美国Sigma公司)；DMEM-F12培养液(美国Hyclone公司)；胎牛血清(美国Biochrom)；青霉素-链霉素(美国Biological Iudustries公司)；二甲基亚砜(DMSO,美国Sigma公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠TM3细胞培养 TM3细胞培养于10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM-F12培养基中，于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养，待细胞铺满T25瓶底80%左右进行传代，传至第3代后开展后续实验。

1.2.2 台盼蓝法测定细胞毒性 当细胞死亡时，由于细胞膜结构发生破损，可透过台盼蓝染料。死亡或失去活力的细胞因为着色，其色调比正常细胞暗淡。Vi-cell细胞活力分析仪通过对该色调明暗进行拍照对比进行活力的检测，以此判断受试物的细胞毒性。应用Vi-cell对细胞进行计数，将8×104/ml的细胞接种于16孔板中，每孔加液量1 ml，接种24 h后吸去培养基，更换无血清培养基进行同步化处理12 h，加入含不同浓度BPA(0、1、10、100、1 000 μmol/L)的含10%胎牛血清的培养液孵育24 h，进行消化，取1 ml细胞悬液上样至Vi-cell细胞活力分析仪中，按照仪器操作说明测定细胞活力，并计算相应的半数抑制浓度(IC50)。

1.2.3 RTCA接种密度测试 应用Vi-cell进行细胞计数，分别将0.5×105、1×105、2×105/ml的细胞200 μl接种于专用的E-plate 8孔板上进行接种数量的预实验。

1.2.4 RTCA法测定细胞毒性 预实验后的细胞接种于8孔板，正常培养基培养24 h后吸去培养基，换做无血清培养基进行同步化处理12 h，加入含不同浓度BPA(0、1、10、100、1 000 μmol/L)的含10%胎牛血清的培养液孵育24 h。通过RTCA系统各孔微电阻量的变化实时监测TM3细胞生长状况，通过细胞生长的动力变化反应曲线，观察BPA对TM3细胞毒性情况，并计算出相应的IC50。

2 结果

2.1 TM3细胞接种密度检测 将3种不同密度的细胞接种于E-plate 8孔板后培养96 h，细胞生长曲线表明，当接种密度为2×105/ml时，细胞在接种24 h后进入指数增长期，因此，后续实验采用2×105/ml的接种密度。见图1。

图1 小鼠睾丸间质细胞不同接种密度生长曲线

2.2 台盼蓝检测法检测BPA对小鼠睾丸间质细胞的细胞毒性 应用Vi-cell细胞活力分析仪检测各浓度BPA暴露24 h后活性细胞比例。与未加入BPA的DMSO对照组比较，各组活细胞比例出现下降的趋势，并且在1 000 μmol/L时下降最为明显，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 台盼蓝检测法分析BPA对TM3的细胞毒性情况

2.3 台盼蓝染色法分析BPA对TM3的细胞毒性 各BPA暴露组的细胞活力IC50为745 μmol/L，根据浓度的反对数所得的浓度曲线如图3所示。

2.4 RTCA分析系统实时监测结果 采用RTCA分析系统实时监测细胞生长情况，共监测70 h，结果显示，无血清同步化处理前细胞呈指数增长的趋势，同步化处理后细胞增长的速度变慢，提示达到同步化处理的目的。加入BPA后，不同浓度的BPA均能使TM3的细胞活力出现不同程度的下降，其中浓度为1 000 μmol/L时下降最为明显。见图4。

2.5 RTCA活力检测法 RTCA活力检测法结果表明，BPA对TM3细胞毒性的IC50为704 μmol/L，其浓度曲线及结果如图5所示。

图3 反对数变换后的细胞活力随浓度变化曲线

图4 RTCA监测BPA对小鼠睾丸间质细胞的细胞毒性作用

图5 RTCA分析系统计算IC50的细胞指数情况

3 讨论

RTCA系统通过专用培养板上的新型传感芯片设计，可连续监测生物反应的全过程，并且其监测是无标记、无创伤型的数据获取和分析平台[5]，其专用的E-Plate板底部铺满微金电极，细胞数量及大小的变化影响电阻抗的变化，其变化反应为电阻值的改变，以细胞指数(CI)的形式输出，能够定量评估细胞数量、存活率及形态变化等细胞生理状态指标。基于阻抗动态检测细胞活力与相应的细胞计数与MTT法得到的结果一致[6]。本实验通过RTCA法与传统的台盼蓝染色法分析BPA对小鼠睾丸间质细胞的细胞毒性过程中，在比较两种方法的同时，也对BPA所导致的细胞毒性情况进行双重验证。

环境雌激素BPA在环境中广泛存在，具有剂量小、潜伏期长和接触频繁等特点，是危害较大的一类环境内分泌干扰物[7]。BPA可通过皮肤、呼吸道、消化道等多种途径进入机体，引起多系统的损伤，如神经系统、代谢系统、免疫系统、生殖系统，并通过基因的改变遗传给下一代，其对生殖系统的损害已越来越受到人们的重视[8-10]。本研究发现，不同浓度的BPA均使TM3细胞活力出现不同程度的降低，其中以1 000 μmol/L下降最为明显。两种方法计算出的IC50均为700 μmol/L左右，其绝对值并不完全相同的原因可能是不同的细胞批次及检测设备灵敏性的差异，但其范围与趋势均相同。从整个实验过程来看，RTCA能够实时监测细胞不同时间的生长状态，从细胞指数曲线上可以直观看到整个实验过程TM3的生长情况，在对处理时间的节点选择上，可以根据细胞的生长情况进行判断，依据更加充分可靠。因此，RTCA系统较好地弥补了传统台盼蓝染色法只能看到终点情况的缺点，其结果与周慧等[11]研究的结果相同。通过对两种方法的比较，我们可以看出，RTCA系统具有更加准确、直观等特点，是一种细胞生物学研究领域的良好实验手段。