病毒核酸检测在无偿献血者中的应用及其质量控制方法的探讨

高智俊,蔡 茵,唐晴钧,周国平,郑 岚

(上海市血液中心检验科 200051)

输血安全一直被社会所关注，尤其是人类免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)、丙型肝炎病毒(HCV)和乙型肝炎病毒(HBV)， 这些病毒主要是通过暴露于污染的血液或血液血浆产品、暴露于特定的机体组织或体液、通过性接触或通过母婴进行传播。血清学检测广泛运用于血液筛查，针对无偿献血者的筛查研究发现，每年仍有新发输血后感染病例报道。这些风险主要来源于感染者窗口期献血、病毒变异、免疫静默感染及实验室操作错误。如美国无偿献血者每单位供血传播HBV的危险性为1/63 000[1]，由此引起的献血者投诉及医疗纠纷成为采供血急需要解决的问题之一。因此单纯抗原或抗体的血清学检测不能有效地保障血液安全。资料证明，90%的HBV、HIV及70%的HCV患者发生感染，血液检测漏检是由窗口期引起的[2]。在目前使用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测试剂的条件下，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV的平均“窗口期”分别为56、82、22 d，而采用核酸检测技术(NAT)HBV、HCV、HIV的平均“窗口期”可分别缩至36、13、11 d[3]。因此大大降低了输血感染的风险。本中心自2015年8月起使用罗氏二代试剂开展核酸检测，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年8月1日至2017年3月31日于本血液中心参加无偿献血者血液标本，使用罗氏核酸系统检测共计384 212例。所有核酸检测的标本均使用PPT管留取血样5 mL， 8 h内1 600 g离心20 min，分离出血浆后2～4 ℃保存，72 h内完成核酸定性(罗氏MPX v2.0)筛查。

1.2仪器与试剂

1.2.1仪器 罗氏Cobas S201核酸血液筛查系统(包括Hamilton STAR IVD Version 2.0.14、Cobas Ampliprep、Cobas TaqMan96)；FAME24/30全自动ELISA后处理系统；Thermo全自动ELISA后处理系统；日立7600全自动生化仪；罗氏P800全自动生化仪； BD PPT管。

1.2.2试剂 核酸定性(罗氏MPX v2.0)筛查试剂盒；国产ELISA检测试剂盒：HBsAg(上海科华)，抗HCV抗体(上海科华)，抗HIV抗体(北京万泰)；进口ELISA检测试剂盒：HBsAg(Murex)，抗HCV抗体(Murex)，抗HIV抗体(Murex)。

1.3方法 标本分为常规标本、加急标本和血小板标本。常规标本先经血液ELISA常规检测后，挑选HBsAg、抗-HCV和抗-HIV阴性或3项中任1项ELISA单试剂阳性标本进行血液核酸定性(MPX v2.0)检测；加急标本和血小板标本采用核酸与ELISA检测平行进行的检测流程。

1.3.1血液EIA常规检测 所有标本先经过国产ELISA试剂初检HBsAg、抗HCV和抗HIV 1/2，以及进口ELISA试剂对上述3项指标复检。

1.3.2血液核酸定性(MPX v2.0)检测 采用罗氏Cobas s201核酸血液筛查系统和核酸定性筛查试剂盒对标本进行核酸混样或单样本检测；混样阳性标本再进行单样本检测，单样本检测阳性则报告该标本阳性。

1.4质量控制

1.4.1室内质控品 每天实验开始时以混样模式检测一套HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA室内质控品、阴性质控品(康彻斯坦生物技术有限公司)，选择合适的浓度通过STAR混样模式使3种阳性室内质控品与3份阴性质控品进行混样检测，另设一孔为阴性室内质控。每套室内质控品监控当天献血者样本检测结果是否有效。

1.4.2试剂盒阴阳性对照品 每架带1份阴性对照和5种阳性对照[HIV-1 M(+)、HIV-1 O(+)、HIV-2 (+)、HCV(+)和HBV(+)]，用于监控每架实验有效性，如果一个架中有某个对照品不合格，则整架结果无效，重新检验。

1.4.3内标 每管设立内标，相当于加入每管中的阳性质控，监测每个反应体系产生假阴性的偶然误差，以确保阴性结果的可靠性。只有当检测样本的内标有效，且试剂盒及室内质控品阴阳性对照的内标有效并且结果符合时，才确认实验结果的有效性。

1.4.4无效及故障统计 统计1年时间内发生无效批次的次数，导致整个批次无效的原因分类统计；对有效批次中出现的无效测试进行统计，查找其发生的原因，进行分类统计。同时对于硬件故障导致的无效，统计故障发生的类型。

1.5统计学处理 采用Microsoft Excel 2003对数据进行整理分析。计数资料采用百分数表示。

2 结 果

2.1核酸检测结果 2015年8月1日本中心开始使用罗氏MPX v2.0试剂，截止2017年3月31日检测样本数384 212例，其中检出ELISA血清学阴性核酸检测阳性的样本共计289例，阳性率为0.075%。

2.2质量控制数据 在2015年8月1日至2017年3月31日共检测室内质控品510次，阴性室内质控失控3次，阳性室内质控失控5次，质控品内标未起1次，失控率1.76%。在2015年8月1日至2017年3月31日参与室间质评8次，其中原国家卫生和计划生育委员会(卫生计生委)临检中心室间质评项目3次，澳大利亚NRL国际室间质评项目5次，本室结果均与预期结果符合，见表1。在2015年8月1日至2017年3月31日核酸检测共4 724批次，无效批次128次，无效率2.71%。其中试剂盒对照引起的无效批次为69次，其余59批次无效均由设备发生故障。无效原因分析，见表2。2015年8月1日至2017年3月31日数据,对检测过程中有效batch中单个无效pool进行了统计，无效测试率0.15%，并对其原因进行了原因分析(表3)，起到预警提示或及时采取相对应措施。收集2015年8月1日至2017年3月31日期间数据,对每台检测设备的主要故障发生进行了分类统计，见表4。

表1 参与室间质评情况

表2 核酸检测无效原因分析统计

表3 单个无效测试频次和原因分类统计分析

表4 设备故障分类统计分析

3 讨 论

根据原国家卫生计生委要求，我国血站已全面广泛开展核酸检测血液筛查项目，为进一步确保血液安全，开展NAT血液筛查已经成为各级血站的重点工作内容。早在2000年之前，国外特别是一些发达国家和地区已先后应用NAT技术进行血液筛检。在日本及欧美等发达国家，NAT已成为常规血液筛查技术，并逐步在全球范围内得到推广[4]。德国和荷兰从1997年起开始了NAT筛查血液的尝试[5]；欧盟委员会规定,1999年7月1日以后所有原料必须经HCV NAT筛查合格后才能投产；美国则从1999年3月开始在FDA批准将NAT技术应用于常规血液筛查；英国和法国的部分血站也从2000年起开始用NAT筛查血液[6]。NAT还可以检出因病毒变异及亚型、隐匿性HBV感染等ELISA而漏检的污染血液。西方发达国家报道HBV、HCV、HIV漏检率分别为几万分之一、几十万分之一、几百万分之一，国内报道的HCV漏检率与国外相近[7-9]。从2005年年初起，美国FDA开始强制要求血液中心和血液制品生产企业采用批准的NAT试剂盒进行血源筛查，强制进行NAT筛查的病毒有HIV-1和HCV。据评估，采用目前获准的NAT筛查试剂，HIV的残余风险低于1∶100万，肝炎的残余风险低于1∶20万[10]。有文献报道，应用不同的核酸检测系统，HBV核酸阳性检出率结果差异较大，有低至0/9 611(8人份混合)，推测是由于核酸检测系统的差异造成。因而，在开展核酸检测前，有必要对核酸检测系统进行评估[10]。

本中心自2015年8月开始使用罗氏MPX v2.0试剂盒起，至2017年3月31日，共有384 212例样本使用该试剂盒进行的核酸检测，在血清学检测阴性的基础上检测出289例样本呈反应性，阳性率达到0.075%。在使用罗氏MPX v2.0试剂盒起1年内，共进行室内质控品检测510次，共发生9次失控，失控率为1.76%。其中阴性室内质控品检测呈反应性3次，阳性室内质控品检测呈非反应性或检测的Ct值大于本实验室质控规则所限定范围5次,质控品内标未起1次。在这段时期内，对于献血者样本共进行试验4 724个批次，无效批次为128次，无效率2.71%；因试剂盒对照引起的无效批次为69次，阴性对照品出现假阳性15次，占全部无效的11.72%；阳性对照品出现假阴性42次，占全部无效的32.80%；扩增曲线异常及系统计算错误导致的无效分别占总无效的6.25%和3.13%，其余59批次无效均由设备发生故障，实验终止所导致，占总无效的46.10%。

室间质量评价是多家实验室分析同一标本，并由外部独立机构收集和反馈实验室上报的结果，以此评价实验室检测能力，它能降低人为或其他原因导致的检测误差风险，提高实验室检测能力[11]。室间质量评价作为一种质量控制工具可以帮助实验室提高检验质量，通过分析实验中存在的问题，采取相应的措施去纠正改善问题，以达到提高检测能力，降低输血风险的目的。定期参加室间质量评价也是判断实验室的检测能力及监控其持续能力。在2015年8月至2017年3月参与原国家卫生计生委临检中心室间质评项目3次，澳大利亚NRL国际室间质评项目5次，本室结果均与预期结果符合。

对于出现阴性室内质控品或试剂盒阴性对照检测呈阳性的情况，一般情况下呈偶发，在这种情况下首先考虑为在操作过程中出现样本间的交叉污染所致，也可能为自动开盖机在开盖过程中造成交叉污染，而不轻易认定实验室污染，实验室发生扩增产物的污染往往为大片出现阳性结果，怀疑时可进行环境监测实验来监测是否发生实验室污染[12]。当发生阴性室内质控品或试剂盒阴性对照检测呈阳性时，可观察当天实验是否出现较多的高Ct值测试，以及观察近日的阳性拆分情况。对于有多套设备的实验室，可以观察多次出现高Ct值测试所在的检测设备是否有特异性。当出现阳性室内质控品或试剂盒阳性对照检测呈阴性或Ct值过高，首先考虑的因素为人为因素，如溶解后的室内质控品或阳性对照品没有充分混匀、没有平衡至室温。当怀疑扩增仪孔间温度不均一或不符合目标温度、仪器加样量准确性、试剂中酶失活等仪器和试剂原因导致的反应体系出现问题时，可通过观察该孔的内标扩增情况，或比较该批次其他孔位、甚至当天或今日所有实验中内标的整体扩增情况，来判断是否出现了系统误差。在排除了以上原因后，考虑该批号或者单支室内质控品、对照品是否出现效价降低。

对于发生在有效批次中的无效测试，对于其报错信息予以分类以及在不同设备上出现的频次进行统计，如对于样本中出现细小凝块的信息提示，根据一段时间内出现的频次，考虑是否近期样本离心不规范，或该批试管质量存在缺陷。若集中出现在某一台设备，可考虑是否该设备的探测系统存在一定问题。

统计导致无效批次的原因发现，设备故障终止实验所导致的无效，占到总无效率的46.10%，对于主要故障进行了分类，并对每台设备的故障重复次数予以整理，这样有助于提醒工程师在维修保养时更加注意此类故障的排除和预防。值得注意的是除了设备应当进行的每年一次的校准以外，当更换或维修涉及试剂样本加样量、孵育温度、荧光信号检测等配件或模块后，应对该涉及内容进行校验。

综上所述，NAT用于献血者血液筛查可以提高输血安全系数，保护献血者资源，保证用血安全，降低输血所引发疾病传播的可能性。在完成日常工作的同时，收集工作检测数据，进行分类整理统计，有助于检测的质量控制，以更好地提高检测质量。