烧伤科患者分离金黄色葡萄球菌耐药性和耐药基因研究*

殷国民，杨 丹，顾常梅，陶 佳，刘文淼

(宁夏医科大学总医院医学实验中心/宁夏临床病原微生物重点实验室，银川 750004)

近年来，烧伤患者金黄色葡萄球菌感染率越来越高，严重威胁到患者的生命。由于烧伤导致患者皮肤屏障功能丧失和免疫反应低下，因此极易发生感染。金黄色葡萄球菌已成为引起烧伤患者感染的重要病原体，由于抗菌药物的不合理使用，其耐药性日益严重[1]。自1961年，第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)在欧洲被发现以来，更多的耐药菌株陆续被发现，其不仅对β-内酰胺类抗菌药物耐药，还对其他抗菌药物如氨基糖苷类、大环内酯类耐药。随着金黄色葡萄球菌的耐药性增加，以及多重耐药株的出现，抗菌药物的选择已成为是烧伤患者治疗中的难题[2]。为了解烧伤患者金黄色葡萄球菌分离株耐药性和耐药相关基因的携带情况，对2015年1―8月烧伤科患者分离的106株金黄色葡萄球菌进行耐药检测和耐药基因分析，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2015年1―8月本院烧伤科住院患者分离的106株金黄色葡萄球菌菌株。同一患者重复分离菌株不再计入。金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC25923、ATCC29213，ATCC43300购自国家卫生和计划生育委员会临床检验中心。

1.2仪器与试剂 5415D微量台式离心机(Eppendorf，Germany)；RAD300电泳仪(Amersham Biosciences，USA)；PCT2100PeltierPCR扩增仪(Bio-Rad，USA)；GIS2210凝胶成像系统(Bio-Rad，USA)。Premix Taq DNA polymerase 和100 bp DNA Ladder Marker购自大连宝生物生物工程公司；琼脂糖购自西班牙Biowest公司；胶红购自北京全式金生物技术有限公司。耐药基因引物参考文献[3]由上海生物工程公司合成。

1.3方法

1.3.1菌种鉴定和药敏试验 采用法国生物梅里埃公司VITEK-2 Compact全自动系统，结果参照美国临床和实验室标准协会(CLSI)2014版药敏标准进行判断。按照CLSI2002年标准推荐，应用mecA基因检测MRSA和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)，即mecA基因检测阳性为MRSA，mecA基因检测阴性为MSSA。

1.3.2细菌基因组DNA制备 无菌条件下将金黄色葡萄球菌接种在血琼脂平板，35 ℃培养箱中培养18～24 h，挑取6～8个单个菌落，混悬于0.5 mL无菌水中，95 ℃煮沸15 min，12 000 r/min离心5 min后取上清即为细菌基因组DNA溶液。

表1 PCR引物序列与目的产物长度

1.3.3PCR基因扩增 25 μL反应体系包括Premix Taq 酶缓冲液12.5 μL，上游、下游引物和DNA模板各1 μL，双蒸水9.5 μL。反应参数：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35个循环，循环结束后72 ℃延伸10 min，耐药基因引物序列及产物长度见表1。

1.3.4产物检测 取5 μL PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，100 bp DNA Ladder Marker作参照，紫外凝胶成像系统观察结果并统计。

2 结 果

2.1标本分布 106株金黄色葡萄球菌中，标本主要为脓液、创面分泌物及痰液。其中，脓液74株(69.8%)，分泌物19株(18.0%)，痰液7株(6.6%)，导管尖端5株(4.7%)，静脉血1株(0.9%)。

2.2金黄色葡萄球菌耐药率 106株金黄色葡萄球菌除对糖肽类抗菌药物替考拉宁和万古霉素均高度敏感，敏感率为100.0%外，对利奈唑胺和替加环素的敏感率均为100.0%。对苯唑西林的敏感率为67.0%。对莫西沙星、复方磺胺甲噁唑、奎奴普汀/达福普利和呋喃妥因的敏感率均达到80%以上，见表2。

表2 106株金黄色葡萄球菌对抗菌药物的敏感率(%)

2.3耐药基因检测阳性率 通常mecA基因阳性可判断为MRSA，本组中65株金黄色葡萄球菌均为MRSA。MRSA和MSSA携带的耐药基因存在差异，在65株MRSA 菌株中检出59株携带有氨基糖苷类、大环内酯类和四环素耐药基因，在41株MSSA菌株中检出6株携带有氨基糖苷类、大环内酯类和四环素耐药基因。106株金黄色葡萄球菌中，β-内酰胺类抗菌药物耐药基因mecA、TEM基因检测阳性率分别为61.3%和30.2%；大环内酯类耐药基因ermA、ermB、ermC基因检测阳性率分别为60.4%、12.3%、56.6%；四环素类耐药基因tetM、tetK和氨基糖苷类耐药基因阳性检测率见表3。金黄色葡萄球菌耐药基因PCR扩增结果见图1。

表3 MRSA和MSSA耐药基因阳性率

注：M为DNA Marker DL100；N为阴性对照

图1金黄色葡萄球菌耐药基因PCR扩增结果电泳图

3 讨 论

金黄色葡萄球菌在自然界中分布广泛，是医院感染及社区感染的常见病原体，可导致多种感染性疾病。烧伤患者由于免疫系统受损，极易受到此菌的感染，皮肤和软组织感染最常见[4-5]。近年来，随着金黄色葡萄球菌对抗菌药物耐药性的不断增加，尤其是MRSA的出现，其已成为威胁生命的病原体。MRSA对β-内酰胺类、氨基糖苷类、喹诺酮类、大环内酯类、林可酰胺类及链阳霉素类等多种抗菌药物同时耐药，是医院感染暴发流行的常见病原体，成为临床抗感染治疗的一大难题[6]。

本研究结果显示，106株金黄色葡萄球菌对万古霉素、替考拉宁、利奈唑胺和替加环素的敏感率均为100.0%，对其他抗菌药物的耐药率较高，与宗自卫等[7]的研究结果一致。mecA基因编码一种新的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)，其与β-内酰胺类抗菌药物亲和力极低从而产生耐药性，是目前鉴定MRSA的金标准。本组共检出MRSA 65株，检出率为61.3%。苯唑西林耐药率为67.0%，mecA基因阳性率为61.3%，耐药表型与耐药基因不一致，推测可能存在其他的耐药机制，如其他亚型的青霉素结合蛋白的改变或产β-内酰胺酶[8]。TEM基因为常见的β-内酰胺酶基因，在球菌和杆菌中广泛存在，本研究中有32株携带TEM基因。

106株金黄色葡萄球菌对庆大霉素耐药率为67.0%，氨基糖苷类耐药基因 aac6′/aph2′′阳性率77.0%，耐药基因检出率高于耐药表型，可能与某些菌携带该耐药基因但该基因未表达有关。MRSA和MSSA均携带有2种氨基糖苷类药物耐药基因(aac6′/aph2′′、ant6)，但MRSA以aac6′/aph2′′为主，MSSA以ant6为主。106株金黄色葡萄球菌对红霉素的耐药率较高，但红霉素耐药基因检出率较低，推测可能存在其他的耐药机制[9]。106株金黄色葡萄球菌对四环素的耐药机制主要有两种：(1)tetK和tetL基因编码的膜蛋白的主动外排作用；(2)tetM基因编码的细菌核糖体保护蛋白，阻止了四环素类抗菌药物与细菌核糖体的结合。金黄色葡萄球菌四环素耐药与tetK及tetM基因密切相关[10]。本研究中，四环素耐药基因tetM和tetK基因的阳性率分别为76.4%、20.7%，以tetM基因为主。在tetM阳性菌株中，同时检测到10株携带tetK基因。tetM、tetk在MRSA和MSSA中均有检出，MRSA以tetM为主，MSSA以tetk为主。

葡萄球菌对大环内酯类抗菌药物，林可酰胺和链霉素(MLS)耐药的机制主要包括：(1)msrA基因编码主动外排泵，可对大环内酯类抗菌药物和B型链霉素耐药；(2)产生酶灭活抗菌药物；(3)抗菌药物作用靶位的改变，即erm基因编码的RNA甲基化酶对细菌核糖体23S rRNA基因甲基化，导致对大环内酯类抗菌药物、林可酰胺和链阳菌素B耐药[11]。erm类基因包括ermA、ermB、ermC和ermF，葡萄球菌中以ermA和ermC基因为主，有研究报道MRSA中ermA、ermC基因最常见[12-13]。本研究中，erm基因以ermA和ermC基因为主，阳性检出率分别为60.4%和56.6%。MRSA以ermA、ermB为主，MSSA以ermC为主。

综上所述，烧伤科患者感染金黄色葡萄球菌对多数抗菌药物耐药率较高，对万古霉素和替考拉宁高度敏感，耐药基因以mecA、ermA、ermC 、tetM和aac6′/aph2′′为主。MRSA耐药基因阳性率高于MSSA，MRSA的氨基糖苷类药物耐药基因(aac6′/aph2′′)、大环内酯类药物耐药基因(ermA，ermB)、四环素类药物耐药基因(tetM)均高于MSSA。对于MRSA感染烧伤患者，需将抗菌药物合理使用和外科手术相结合，正确处理烧伤创面，及时治疗MRSA感染控制其传播流行。