感染性心内膜炎患者的主要病原菌耐药基因检测*

王 佳，高 辉，徐 益，黄云昆，朱雯梅，姚 瑶，俸 玉

(昆明医科大学附属延安医院/云南心血管病医院检验科，昆明 650051)

感染性心内膜炎是由病原菌直接感染而引起的心瓣膜、心室壁或邻近大动脉内膜的炎症性疾病，引起感染的病原体以细菌最常见，也可由真菌、病毒、立克次体、衣原体属、螺旋体等其他微生物引起。据目前的文献报道，感染性心内膜炎的病死率高达20.0%，已成为威胁人类健康的重要疾病，故及早的诊断和治疗对感染性心内膜炎起到重要作用[1]。本研究对本院感染性心内膜炎分离的主要病原菌进行耐药基因检测，分析耐药表型与耐药基因的关系，为临床合理用药提供参考。

1 材料与方法

1.1菌株来源 实验菌株来自本院2016年9月至2017年3月临床以Duck标准确诊为感染性心内膜炎的血培养阳性瓶分离病原菌。

1.2仪器与试剂 抗菌药物纸片、Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 细菌DNA提取试剂盒、Oligo公司的引物、琼脂糖、Loading Buffer、DNA Marker、Taq酶，水浴箱、离心机、电泳仪、PCR扩增仪、凝胶成像系统。

1.3方法

1.3.1标本采集与细菌分离 收集临床感染性心内膜炎血培养阳性标本分离出来的草绿色链球菌和葡萄球菌。符合要求的草绿色链球菌和葡萄球菌各有5株。

1.3.2药敏及保存 纸片法测分离细菌的药敏，然后把细菌保存在-70 ℃低温冰箱里。

1.3.3DNA模板的制备 用Omega公司的Bacterial DNA Kit D3350-01 细菌DNA提取试剂盒，按照说明书步骤提取草绿色链球菌和葡萄球菌DNA。取5 μL提取产物与1 μL Loading Buffer混合，点样，1%琼脂糖凝胶120 V电泳40 min，用凝胶成像系统分析并记录结果[2]。-20 ℃保存DNA待用。

1.3.4PCR扩增 1～5号为草绿色链球菌，对草绿色链球菌检测的β-内酰胺类耐药基因主要是PBP1a、PBP2b、PBP2x，选取肺炎链球菌为标准阳性菌株；6～10号为葡萄球菌，对葡萄球菌检测的耐甲氧西林基因mecA，耐大环内酯类基因ermB。委托欧阳科技公司合成引物。引物序列见表1。

表1 PCR引物

PCR反应体系30 μL，包括：细菌DNA 3 μL，引物1 μL(上下游分别0.5 μL)，Taq酶12 μL,剩余超纯水补足。反应温度：96 ℃预变性3 min，94 ℃ 1 min，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，扩增40个循环，最后72 ℃ 延伸10 min[3]。取5 μL扩增产物与1 μL Loading Buffer混合，点样，1%琼脂糖120 V电泳40 min，凝胶成像系统分析并记录结果。

2 结 果

2.1菌株药敏试验结果 选取的1～5号草绿色链球菌药敏试验结果(表2)，显示5株细菌均对青霉素敏感，选为标准阳性对照的肺炎链球菌药敏试验结果显示对青霉素耐药。6、7、8、10号菌株对甲氧西林耐药，6、7、8、9号菌株对红霉素耐药，见表3。

2.2耐药基因检测结果 图1、2为草绿色链球菌和作为标准阳性对照的肺炎链球菌的耐药基因检测结果，可见草绿色链球菌未检测出PBP1a、PBP2b和PBP2x基因，肺炎链球菌PBP1a、PBP2b和PBP2x基因均被检测出。图3为葡萄球菌检测结果，6、7、8、10号菌株检测出mecA基因，6、7、8、9号菌株检测出ermB基因。

表2 草绿色链球菌对青霉素的药敏试验结果

注：S为敏感；R为耐药

表3 葡萄球菌药敏试验结果

注：S为敏感；R为耐药

图1 草绿色链球菌检测结果

图2 草绿色链球菌和肺炎链球菌检测结果

2.3药敏试验及基因检测结果 5株草绿色链球菌均对青霉素敏感，肺炎链球菌对青霉素耐药，对草绿色链球菌和肺炎链球菌进行PBP1a、PBP2b和PBP2x基因检测，草绿色链球菌未检测到这3个基因，肺炎链球菌3个基因均为阳性，药敏结果和基因检测结果见表4，基因型与耐药表型一致。5株葡萄球菌中，6、7、8号葡萄球菌对红霉素耐药且耐甲氧西林阳性，3例菌株均检测出mecA和ermB基因。9号溶血葡萄球菌对红霉素耐药，耐甲氧西林阴性，10号表皮葡萄球菌则相反，对红霉素敏感，耐甲氧西林阳性，对9、10号进行耐药基因检测中，笔者发现9号溶血葡萄球菌检测到ermB基因而没有检测到mecA基因，10号表皮葡萄球菌检测到mecA基因而没有检测到ermB基因，基因型与耐药表型一致，药敏试验结果和基因检测结果，见表4、5。

图3 葡萄球菌检测结果表4 草绿色链球菌和肺炎链球菌耐药基因检测结果

编号细菌青霉素耐药基因检测结果1草绿色链球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)2草绿色链球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)3草绿色链球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)4草绿色链球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)5草绿色链球菌SPBP1a(-)、PBP2b(-)、PBP2x(-)阳性对照肺炎链球菌RPBP1a(+)、PBP2b(+)、PBP2x(+)

注：S为敏感；R为耐药

表5 葡萄球菌耐药基因扩增结果

注：S为敏感；R为耐药

3 讨 论

感染性心内膜炎是指由细菌、真菌和其他微生物直接感染而产生心瓣膜或心室壁内膜的炎症[2-3]。随着医疗技术地不断进步，人工瓣膜植入常用于治疗心脏病，以及各种侵入性操作的广泛应用，细菌性血症病例也渐渐增多[4]。常见的病原菌分布较为广泛，以草绿色链球菌、葡萄球菌等条件致病菌相对多见，感染性心内膜炎临床表现多样，如发热、心脏杂音、心力衰竭和脾肿大等，是心脏内外科较常见而且难以处理的一种严重疾病，其症状可以单独出现也可以伴随其他疾病，如自身免疫性疾病，给临床诊断带来干扰[5-6]。

据统计，2011―2015年本院感染性心内膜炎患者病原菌中共分离出草绿色链球菌104例，占37.1%，为主要病原菌；表皮葡萄球菌30例，占10.7%。草绿色链球菌对红霉素、克林霉素耐药率较高,均为54.5%；对头孢噻肟的耐药率为9.1%，头孢曲松为2.3%，目前没有检测到耐青霉素的草绿色链球菌。葡萄球菌对青霉素的耐药率为100.0%，对红霉素和四环素的耐药率分别为57.1%和61.9%[7]。草绿色链球菌主要对红霉素和克林霉素的耐药率较高，葡萄球菌普遍对青霉素G、苯唑西林、红霉素、克林霉素等耐药。青霉素结合蛋白(PBPs) 作为β-内酰胺类抗菌药物作用于细菌的必需蛋白，当细菌编码PBPs 的基因发生变异，可以导致PBPs的数量、种类或与抗菌药物的亲和力发生变化，造成细菌结合β-内酰胺类抗菌药物的能力降低，进而导致细菌耐药性的产生[8]。ermB 基因介导靶位点修饰。ermB 基因编码核糖体甲基化酶,可使细菌23S rRNA A2058 位点的腺嘌呤残基N-6 位二甲基化。其耐药表型为大环内酯类-林可酰胺类-链阳菌素B (MLS),即对大环内酯类、林可酰胺类抗菌药物和链阳性菌素B 交叉耐药,可被分为固有型MLS耐药(cMLS) 和诱导型MLS耐药(iMLS),后者表现为仅对大环内酯类抗菌药物耐药,当耐药基因被完全诱导时,则表现为结构型耐药。mecA基因编码PBP2a，PBP2a具有其他高亲和力PBPs的功能，当高亲和力的PBPs被β-内酰胺类抗菌药物结合而失去功能时，PBP2a的存在仍能维持细菌生长与存活，使其成为耐药菌株。因此对感染性心内膜炎患者进行主要病原菌耐药基因检测是非常有必要的。

本实验选取了5株草绿色链球菌和5株葡萄球菌进行基因检测，所有细菌DNA均提取成功。对草绿色链球菌进行PBP1a、PBP2b和PBP2x基因检测(图1)，选肺炎链球菌为标准阳性菌株进行PBP1a、PBP2b和PBP2x基因检测(图2)。从图中可以看出草绿色链球菌基因扩增结果均为阴性，肺炎链球菌基因扩增结果为阳性，结合药敏结果(表2)中草绿色链球菌对青霉素敏感和肺炎链球菌对青霉素耐药可见耐药基因基因检测结果与药敏结果一致。同时，本实验还选取了5株葡萄球菌进行mecA和ermB基因检测(图3)，结合葡萄球菌药敏结果表3可见对甲氧西林耐药菌株均检测出mecA基因，对红霉素耐药菌株均检测出ermB基因，耐药表型和基因型相对应。

据文献报道，草绿色链球菌对青霉素耐药是因为携带PBP1a、PBP2b和PBP2x基因编码导致的，葡萄球菌对甲氧西林和大环内酯类耐药，也是由于其携带mecA和ermB基因[9-10]。本实验选取5株对青霉素敏感的草绿色链球菌，并未检测出

其携带PBP1a、PBP2b和PBP2x基因，而5例葡萄球菌中，对大环内酯类耐药菌株均检测出ermB，耐甲氧西林阳性菌株均检测出mecA基因，结果与文献报道相符合。

综上所述，本研究发现可以通过耐药基因检测，对临床感染性心内膜炎患者早期用药起到指导作用。本次检测耐药基因实验为一个预实验，根据实验结果，可以看出该实验初步条件已成熟，之后可以收集更多病原菌，继续开展后续实验。完成后续实验，将结果进行统计学分析，最终掌握本地区草绿色链球菌和葡萄球菌流行的耐药表型及其相应的耐药基因，促进临床合理选择抗菌药物,提高感染性心内膜炎患者的治愈率及生存率。