柚子皮基香芹酚抗菌膜的制备及性能

雷晏琳，彭巧梅，吴贺君*，董知韵，于冰洋，申光辉，张志清，黎杉珊

随着人们对食品安全问题的日益重视和环保意识的不断增强，可食性包装因能缓解塑料包装可能产生的食品污染及其废弃物造成的“白色污染”等问题，对其研究正逐渐成为当前食品工业和包装领域科技发展的重要趋势[1]。其中，果蔬基可食性膜（又称果蔬纸）是以水果和蔬菜等天然农副产品为基材，添加合适的辅助剂（如增稠剂和增塑剂等）制成的一类可食性包装材料[2]，是一种兼具可食和包装功能的新型果蔬深加工产品，不仅保留了果蔬的大部分营养，同时具备一定的机械性能和阻隔性能[3]，绿色无毒且能自然降解，近年来已经成为食品行业的一大研究热点。

现有文献报道关于果蔬基可食性膜大多是以新鲜果蔬为原料来制备，因其营养丰富而容易滋生微生物，对膜的贮藏特性和包装效果造成不利影响[4]。因此，强化果蔬基可食性膜的抗菌活性、防止膜自身及被包装食品受到微生物污染成为该领域重要的研究方向之一[5]。目前植物精油作为天然抗菌剂，因其特有的安全性优势和良好的抗菌活性，在可食性膜领域中受到广泛关注[6]。国外学者的研究表明，添加香芹酚等精油能显著提升苹果膜抵抗沙门氏菌、埃希氏大肠杆菌和单增李斯特菌的能力，可用于鸡胸肉和火腿等肉制品和畜禽产品的包装[7-8]。王新伟等[9-10]也研究了香芹酚等对胡萝卜膜热学性能和吸湿性能的影响，以期为其作为可食性包装材料应用于食品加工提供数据参考。从可持续发展的角度来看，相比于直接利用新鲜果蔬，以果蔬加工副产物为原料制备果蔬基可食性膜更具经济效益，同时也有利于资源的循环利用和环境保护，应该引起研究者的重视。本课题组前期以柚子皮等果蔬加工副产物为原料制备了一系列果皮基可食性膜[11-13]，优化确定了其最佳的制备配方和工艺参数，发现柚子皮浆料质量分数5%、甘油质量分数1%、海藻酸钠质量分数0.4%时，柚子皮基膜各项性能均较好。为使柚子皮基膜获得较好的抗菌活性，本实验进一步研究香芹酚的添加量对柚子皮基膜外观、微观结构、阻隔性能、机械性能及抗菌活性等的影响，为后期基于果皮的可食性抗菌膜的实际应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

柚子皮：柚子品种为琯溪蜜柚，于雅安水果市场收集。

海藻酸钠、甘油、氯化钠（分析纯） 成都市科龙化工试剂厂；去离子水由实验室自制；牛肉膏、蛋白胨（生化试剂） 北京奥博星生物技术有限责任公司；琼脂粉、香芹酚（生化试剂） 天津市光复精细化工研究所。

1.2 仪器与设备

FJ-200-SH型数显高速分散均质机 上海标准模型厂；SHB-III型循环水式真空泵 巩义市英裕华科仪器厂；CS101型电热鼓风干燥箱 重庆试验备制造厂；HD-E702-100型恒温恒湿箱、HD-B609B-S型电脑伺服拉力材料试验机 海达国际仪器有限公司；148-121型螺旋测微器 郑州中天实验仪器有限公司；W3/031型水蒸气透过率测试仪 济南兰光机电技术有限公司；玻璃成膜器（模腔尺寸为20.0 cm×50.0 cm×0.5 cm）由实验室自制；GZ-150-M型霉菌培养箱 韶关市广智科技设备有限公司；SW-CJ-2FD型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；BHC-1300IIA2型洁净工作台 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；Nicolet IS10型傅里叶变换红外光谱仪 美国赛默飞公司；ZNC-300型超微粉碎机 北京燕山正德机械设备有限公司；WGW光电雾度仪 上海仪电物理光学仪器有限公司；TCP2全自动测色色差仪 北京奥依克光电仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 柚子皮基抗菌膜的制备

柚子皮基膜的制备方法参照本课题组前期的研究[11]，其制备流程如下：选择新鲜的柚子皮，无腐蚀、无脏污、无虫蛀等，将其切碎至2 cm×2 cm左右的方块，放入烘箱中在60 ℃下干燥24 h。使用超微粉碎机将其打磨成粉，放入塑封袋，备用。称取适量柚子皮粉加入一定量的蒸馏水制成膜浆料，膜浆料中加入一定质量分数的增稠剂（海藻酸钠）和增塑剂（甘油）在14 000 r/min下均质15 min，使浆汁细腻均匀。将不同质量分数（0.5%、1.0%、1.5%、2.0%）的香芹酚加入柚子皮膜液中，均质5 min得到均匀浆料，空白膜不加香芹酚。于常温、真空度为－0.095 MPa下脱气以除去溶解在浆料中的气泡，将脱气后的浆料静置10 min，每次取200 mL浆料流延至成膜器表面，于60 ℃热风干燥4～5 h，最后将干燥后的半成品拿出，室温下晾置，小心揭膜得到成品，置于温度为23 ℃、相对湿度为55%的恒温恒湿箱中平衡48 h。

1.3.2 柚子皮基抗菌膜性能的测定

1.3.2.1 色差的测定

采用全自动测色色差计测定柚子皮基抗菌膜的色泽差异，L*值代表明度，a*值代表红绿色度，正值表示红色程度，负值表示绿色程度，b*值代表黄蓝色度，正值表示黄色程度，负值表示蓝色程度，用标准白板GSB A67002-86（L＝96.69、a＝－0.64、b＝0.28）校正，并根据公式（1）计算总色差ΔE。

1.3.2.2 透光率的测定

参照GB/T 2410—2008《透明塑料透光率和雾度的测定》，采用光电雾度仪测定光通量T，将膜剪成正方形（50 mm×50 mm），每组做5 个平行试样，按公式（2）计算透光率Tt。同时用膜包裹葡萄，用相机拍下薄膜的透光效果。

式中：T1和T2分别为入射光通量和透射光通量/%，其中T1为100%。

1.3.2.3 傅里叶变换红外光谱分析

用傅里叶变换红外光谱仪对空白柚子皮基膜和含不同质量分数香芹酚的柚子皮基抗菌膜样品进行傅里叶变换红外光谱分析，扫描范围为4 000～500 cm－1。

1.3.2.4 扫描电子显微镜观察

将样品置于50 ℃的恒温干燥箱中干燥12 h，取约2 mm×2 mm的试样，以导电胶固定于金属载物片上，于离子溅射仪中真空状态下表面镀金，取出样品台，放入钨灯丝扫描电子显微镜，抽真空20 min后进行观察，电子束加速电压为20 kV。

1.3.2.5 厚度的测定

用螺旋测微器在膜表面随机测量5 个点，取平均值，厚度单位为mm。

1.3.2.6 水蒸气透过系数的测定

水蒸气透过系数按照GB/T 1037—1988《塑料薄膜和片材透水蒸气性试验方法 杯式法》及GB/T 16928—1997《包装材料试验方法 透湿率》进行测定。试样面积33 cm2，以水蒸气透过率测试仪配套软件计算得到水蒸气透过系数，其单位为g·cm/（cm2·s·Pa）。

1.3.2.7 抗拉强度、断裂伸长率的测定

参考GB/T 1040.3—2006《塑料 拉伸性能的测定 第3部分：薄塑和薄片的试验条件》，使用电脑伺服拉力材料试验机测定。试样尺寸为80 mm×15 mm，初始间距为35 mm，拉伸速率为60 mm/min，每组做10 个平行试样，抗拉强度（tensile strength，TS）、断裂伸长率（elongation at break，EB）分别按公式（3）、（4）计算。

式中：F为试样断裂时承受的最大张力/N；A为试样横截面积/mm2。

式中：L0为试样测试前的长度/mm；L为试样在断裂时的长度/mm。

1.3.2.8 抗菌活性的测定

参照Du Wenxian等[7]的方法，通过抑菌圈法测定柚子皮基抗菌膜的抑菌效果。

1.4 数据处理与分析

以SPSS 20.0软件处理实验数据，数据表示为±s。采用Duncan多重比较检验法进行显著性分析，以P＜0.05表示差异显著，以Origin 8.0软件对数据进行拟合并作图。

2 结果与分析

2.1 香芹酚质量分数对膜颜色和透光率的影响

表1 香芹酚质量分数对柚子皮基抗菌膜颜色及透光率的影响Table 1 Effect of carvacrol concentration on color and light transmittance of pomelo peel based films

从表1可以看出，随着香芹酚质量分数的增大，柚子皮基膜的L*值逐渐减小，而b*值及ΔE值均增大。L*值的变化说明柚子皮基抗菌膜的亮度有所减弱，b*值的变化则说明其颜色逐渐变黄，ΔE值的变化说明其颜色更加鲜艳。这是由于：一方面原料柚子皮中含有黄色素而使所制备的空白柚子皮基膜呈现淡黄色；另一方面香芹酚本身也为黄色的油状液体，加入后会使膜的颜色进一步加深。同时，膜的透光率也随香芹酚质量分数的增大而有所下降。空白柚子皮基膜的透光率最高，用作包装材料时将具有良好的内装物展示效果；而加入香芹酚后，因受到精油的分布及精油与成膜基质之间的相互作用的影响[5]，进一步阻碍了光的透过，使柚子皮基抗菌膜透光率有所下降。

图1 添加香芹酚前后柚子皮基膜的数码照片Fig. 1 Pictures of pomelo peel based film with and without carvacrol

如图1所示，相比于空白柚子皮基膜，加入1.0%香芹酚后膜的颜色逐渐变黄且亮度略显暗淡，可能会在一定程度上影响视觉效果，这和表1的测定结果是一致的，但透过膜仍然可以看到里面包装的葡萄。因此总体而言，本实验制备的柚子皮基（抗菌）膜呈浅黄色，且外观平整光滑，同时具有一定的透光性，在果蔬保鲜膜等可食性包装领域具有潜在应用价值。

2.2 傅里叶变换红外光谱分析结果

图2 添加香芹酚前后柚子皮基膜的傅里叶变换红外光谱图Fig. 2 Fourier transform infrared spectra of pomelo peel based films with and without carvacrol

采用傅里叶变换红外光谱仪进一步研究香芹酚添加前后柚子皮基膜分子结构的变化，因扫描时发现空白柚子皮基膜与及柚子皮基抗菌膜的傅里叶变换红外光谱图间有明显的差异，而含不同香芹酚质量分数的柚子皮基抗菌膜间差异微小，故在图2中仅给出了空白柚子皮基膜及含有1.0%香芹酚的柚子皮基抗菌膜的傅里叶变换红外光谱图以供对照分析。在图2曲线a中，波数为3 283.67 cm－1处较宽的吸收峰归属为O—H伸缩振动吸收峰，证明膜中存在处于缔合状态的氢键；2 918.23 cm－1处的吸收峰对应于C—H的伸缩振动；1 742.94 cm－1处的窄峰为C＝O伸缩振动峰；1 605.27 cm－1处的吸收峰是芳香环上C＝C伸缩振动；1 024.13 cm－1处的吸收峰则来自于C—O—C的对称伸缩[14-15]。而加入1.0%香芹酚后，相比于空白柚子皮基膜，图2曲线b中柚子皮基抗菌膜的O—H伸缩振动峰波数为3 269.13 cm－1，明显向低波数移动，说明香芹酚与膜组分间发生了相互作用[14]；同时该吸收峰的强度有所下降，说明抗菌膜的亲水性减弱[16]。这是由于香芹酚本身是一种含羟基的疏水性物质，其加入后能与膜中纤维素和果胶等主要大分子组分通过表面羟基形成氢键等相互作用，提高膜的疏水性，进而可能会对膜的微观结构和宏观性能产生一定的影响。

2.3 扫描电子显微镜观察

由图3a、b可见，空白柚子皮基膜表面较为光滑平整，无裂纹、孔洞等缺陷，横断面结构紧凑。这是由于柚子皮本身富含纤维素和果胶等多糖类大分子物质[17-18]，是一种良好的成膜基质，在适当的辅助剂配合作用下成膜后具有较为稳定的微观组织结构。而添加1.0%香芹酚后的柚子皮基抗菌膜的表面变得更为粗糙，膜的结构也相对松散（图3c、d）。这是由于香芹酚加入后与膜组分的大分子形成氢键等作用，部分取代了膜本身大分子之间较强的相互作用，同时膜在干燥过程中由于香芹酚的挥发会留下一些凹洞，导致膜的连续性和紧密结构遭到破坏[19-21]。结果表明香芹酚的添加会对膜的表面和结构产生较大影响，应控制在适当比例。

图3 添加香芹酚前后柚子皮基膜的扫描电子显微镜图（×2 000）Fig. 3 Scanning electron microscopic images of pomelo peel based films with and without carvacrol (× 2 000)

2.4 香芹酚质量分数对膜厚度及水蒸气透过系数的影响

表2 香芹酚质量分数对柚子皮基抗菌膜厚度及水蒸气透过系数的影响Table 2 Effect of carvacrol concentration on thickness and water vapor permeability of pomelo peel based films

由表2可知，在相同成膜浆料量（200 mL）的情况下，柚子皮基抗菌膜的厚度随着香芹酚质量分数的增加而增大，其厚度范围约在0.103～0.143 mm。香芹酚加入后与膜组分大分子间形成氢键等相互作用，打乱了大分子链之间原有的紧密连接，使膜的结构变得较为松散，导致膜厚度增加[21]，这在图2、3中都已得到证实。同时，膜结构的变化也会对其阻隔性能产生一定的影响。水蒸气透过系数是评价膜阻隔性能的重要指标。随着香芹酚质量分数的增加，膜的水蒸气透过系数先增加后降低。这一方面是由于香芹酚的加入使得膜原本紧凑的结构变得疏松，故阻隔性能变差；另一方面是由于香芹酚的疏水性质，在膜中会阻止水分子与膜结合及向膜内部的渗透，提高膜的阻湿性[21-22]。在香芹酚质量分数较大（质量分数大于1.0%）时，后者成为主要的影响因素，此时柚子皮基抗菌膜的水蒸气透过系数减小，说明其阻湿性有所提高。

2.5 香芹酚质量分数对膜力学性能的影响

如图4所示，随着香芹酚质量分数的增加，柚子皮基抗菌膜的抗拉强度逐渐降低，而断裂伸长率却随之升高。相比于空白柚子皮基膜（抗拉强度（18.87±0.93）MPa、断裂伸长率（13.72±0.24）%），含2.0%香芹酚的柚子皮基抗菌膜抗拉强度减小至（9.45±0.51）MPa，降低约50%；而断裂伸长率则增加到（21.35±0.94）%，提高了56%。柚子皮基抗菌膜力学性能的变化与其本身微观网络结构和分子间作用力有关[16]。由于香芹酚加入后会与膜组分通过表面羟基形成氢键等方式部分取代膜组分原本分子链之间较强的相互作用，使膜的微观连续结构受到破坏，故使得膜的抗拉强度降低[16,23]；另一方面，香芹酚存在于膜组分的大分子链之间，有一定的增塑作用，使大分子链的刚性减弱而柔性增加，宏观表现为膜更加柔软，故断裂伸长率增大[24-26]。考虑到膜在实际应用中需要具备一定的力学性能以满足包装用膜的基本要求，故应控制香芹酚在抗菌膜中的用量，使其兼顾一定的强度和韧性。本实验中，当香芹酚质量分数为1.0%时，柚子皮基抗菌膜的抗拉强度和断裂伸长率均适宜，综合力学性能良好。

图4 香芹酚质量分数对柚子皮基抗菌膜抗拉强度和断裂伸长率的影响Fig. 4 Effect of carvacrol concentration on tensile strength and elongation at break of pomelo peel based antimicrobial films

2.6 香芹酚添加量对膜抗菌活性的影响

表3 不同香芹酚质量分数柚子皮基抗菌膜对微生物的抑菌圈面积Table 3 Inhibition zone areas of pomelo peel based films incorporated with different concentrations of carvacrol

由表3可知，空白柚子皮基膜没有抗菌效果，而添加香芹酚作为抗菌剂使膜对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种受试菌均产生了良好的抗菌效果，抑菌圈面积随着香芹酚质量分数的增加而增大，但对金黄色葡萄球菌的抑制作用更加明显。香芹酚的抗菌机理主要是作用于微生物细胞膜，增加细胞膜的流动性，破坏膜结构，使胞内重要离子和内容物渗漏导致细胞死亡，从而抑制了细菌的繁殖[27-28]。Burt等[29]的研究也表明，植物精油对革兰氏阳性菌的抑菌效果强于革兰氏阴性菌，因为革兰氏阴性菌细胞壁外还包裹着一层膜，其中含有脂多糖，限制了疏水性化合物通过膜表面的扩散，故抗菌效果相对较差。需要注意的是，提高香芹酚的质量分数虽然会使膜获得更好的抗菌活性，但前文测试结果也已表明该类精油的加入会改变膜本身的致密结构，对膜的一些理化性能（如颜色、透光率和力学性能等）产生不利影响；同时香芹酚一般具有很强的气味，也会影响膜的感官品质。因此在实际使用过程中要结合膜的其他性能来综合考虑以确定适宜的质量分数。

3 讨 论

果蔬基可食性膜是一种新型的果蔬深加工产品，可作为休闲食品或绿色包装材料，是目前国内外食品研究的热点之一[2,4]。与其他可食性膜类似，果蔬膜因营养丰富而容易滋生微生物，对其自身贮藏特性和包装保鲜效果会产生不利的影响，因此通过与植物精油等天然抗菌剂复合来强化其抗菌性是本领域研究的一个重要方向[6-7]。本实验以柚子皮为主要原料，添加香芹酚制备了柚子皮基抗菌膜，研究发现，香芹酚质量分数对膜的理化特性、微观结构、阻湿性和抗菌活性等均有一定的影响。色泽是反映膜外观的重要指标，加入香芹酚后，膜的b*值和ΔE值升高，说明膜颜色变黄且愈发鲜艳。这与Ravishankar等[8]制备的含香芹酚的苹果膜、曾少甫等[21]制备的含肉桂醛的壳聚糖膜的颜色变化结果一致，其主要是受分布在膜中的香芹酚本身的颜色（黄色）影响。傅里叶变换红外光谱显示香芹酚加入后柚子皮基抗菌膜在3 269.13 cm－1处O—H的伸缩振动峰向低波数移动且强度减弱，这种现象在含柑橘类精油[22]或绿茶提取物[30]的壳聚糖膜中也曾被报道，说明添加的香芹酚与膜组分（如纤维素和果胶等）间形成了部分氢键或共价键等相互作用。扫描电子显微镜观察结果表明加入香芹酚后，柚子皮基抗菌膜的致密性和连续性遭到破坏，膜的结构变得较为松散（如膜厚度增加）。Laura[19]、Wang Lina[20]、曾少甫[21]等在制备含精油的抗菌膜时也观察到相似的形态结构，表明精油的加入会使膜的表面和结构发生较大变化，进而影响其物理性能。

对于阻湿性而言，疏水性的香芹酚在改变柚子皮基膜本身的致密结构的同时也会增强膜对水分子的位阻效应，最终能够改善膜的水蒸气透过性而使其水蒸气透过系数降低，Du Wenxian[7]、曾少甫[21]等也得到过相似结果。对于力学性能而言，香芹酚的添加会打破柚子皮基抗菌膜组分之间的连续性并起一定的增塑作用，使膜变得更为柔软，故其抗拉强度降低而断裂伸长率提高，Du Wenxian等[24]把肉桂精油等加入到苹果膜也中得到类似的结果。但也有文献报道不同甚至相反的结果，例如Du Wenxian等[7]采用连续铸膜和分批量铸膜两种不同方法制备含香芹酚的苹果基抗菌膜，发现随香芹酚含量的增加苹果膜的抗拉强度增大，而断裂伸长率略微增加，但其并未对此现象进行解释。Arrieta等[16]在制备含香芹酚的甘油增塑酪蛋白酸钙可食性膜时发现，添加香芹酚可以通过增强聚合物基体大分子链的相互作用而提高膜的力学性能，尤其是抗拉强度。造成上述差异的原因可能在于可食性膜的机械性能受成膜基质、膜组分间相互作用及制膜条件等多种因素的影响，故应通过合理调控保证膜能够同时兼备一定的强度和韧性，以更好地满足实际应用要求。添加香芹酚赋予柚子皮基膜良好的抗菌活性，其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抗菌效果，但对后者的作用更为显著。Rojas-Graü等[31]的研究发现，在苹果膜中添加精油或精油混合物（质量分数0.1%～0.5%）能提高其对埃希氏大肠杆菌O157:H7的抗菌活性，且随着精油质量分数的增加，其抑菌圈面积也逐渐增大，其中香芹酚抗菌能力最强。Otoni等[26]在考察含质量分数1%肉桂醛的木瓜膜的抗菌活性时，同样发现膜对金黄色葡萄球菌的抗菌效果要强于大肠杆菌。果蔬基可食性膜抗菌活性的提高不仅有利于其自身贮藏，同时也能增强其对食品的包装保鲜作用。但考虑到精油对膜的理化性能和感官品质可能产生的不利影响，合理控制精油添加量尤为关键。除此之外，微胶囊技术、纳米技术等在精油等抗菌剂缓释控制上的应用、抗菌因子的释放特征及其动力学、体外保鲜实验等都是这类含精油可食性抗菌膜今后需要深入研究的主要方向。

4 结 论

综合上述实验结果，考虑香芹酚本身气味、颜色及其与膜组分大分子相互作用对膜物理性质、微观结构、力学性能和抗菌活性的影响，初步确定当香芹酚的质量分数为1.0%时，柚子皮基香芹酚抗菌膜具有相对较好的综合性能，在食品包装领域具有潜在的应用前景。通过本研究能够为以果蔬废弃物为原料的新型果蔬基可食性抗菌膜的研发及其在食品包装方面的应用提供一定的理论指导和实验参考。