澳洲茄边碱通过逆转TAMs表型抑制CNE-1裸鼠移植瘤增殖的机制

★ 梁琰（北大医疗淄博医院 山东 淄博 255069）

鼻咽癌在我国的发病率和死亡率远远高于世界平均水平，且预后效果较差、生存率较低［1］。近年来，肿瘤微环境逐渐成为研究热点，其与肿瘤发生发展的关系尚不明确。而肿瘤相关巨噬细胞（tumorassociated macrophages，TAMs）是肿瘤微环境的重要组成部分，其与肿瘤细胞相互作用，能够分泌多种与肿瘤增殖、转移和预后等密切相关的细胞因子，

进而促进肿瘤细胞的生长、转移和耐药等［2］。但TAMs所具有的表型转化机制为巨噬细胞免疫重塑提供了先决条件，也为肿瘤治疗提供了一个重要方向。本文通过建立人鼻咽癌CNE-1裸鼠移植瘤模型，探讨澳洲茄边碱对肿瘤细胞体内增殖的影响，并检测外周血中相关细胞因子表达情况，从逆转TAMs表型角度探讨澳洲茄边碱与细胞增殖的关系。

1 材料与方法

1.1 动物与瘤株实验动物为SPF级BALB/C裸鼠，18～20g，雄性，36只，购于北京维通利华有限公司，动物合格证编号：11400700223248。饲养环境为温度为18℃～29℃，日温差≤3℃，相对湿度达40%～70%，新鲜空气换气次数10次/h，气流速度≤0.18m/s，压差25Pa，洁净度一万级，氨浓度15mg/m3，噪音≤ 60dB，照度 150～300Lux。人鼻咽癌细胞CNE-1购于中科院细胞库。

1.2 药物与造模澳洲茄边碱单体购于成都曼斯特公司。造模：取对数生长的CNE-1细胞株，用含2%的血清的1640培养基稀释为1.5×107/mL，以1mL注射器吸取100μL细胞悬液，皮下注射于裸鼠右侧腋下，5天后长出米粒样质硬瘤体，造模成功。

1.3 其他实验材料与仪器RPMI-1640培养基（Gibco公司，批号：C11875500CP）；胎牛血清（Gibco公司，批号：1600044）；胰酶（Gibco公司，批号：25200072）；磷酸盐缓冲液（HyClone公司，批 号：SH30256.01B）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa公司，货号：RR047A）；SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（TaKaRa公司，货号：RR820A）；6孔板（Thermo公司，批号：140675）；12孔板（Corning公司，批号：3513）、96孔板（Corning公司，批号：3599）；ELISA试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司，IL-4批号：EK0405，IL-6批号：EK0411、IL-10批号：EK0417、IL-12批号：EK0932、IL-13批号：EK0425、TNF-α批号：EK0527）。

高速匀浆机（Bertin公司）；全自动细胞计数仪（Inno-Alliance Biotech公司）；离心机（京立离心机有限公司，型号：LD5-10B）；正置显微镜（Leica公司，型号：DC300F）；多标记微孔板检测仪（PerkinElmer公司，型号：VICTORTMX5）；冷冻离心机（Eppendorf公司，型号：5430R）。

1.4 分组及处理将裸鼠随机分为3组，每组12只，分别为：荷瘤对照组、澳洲茄边碱低剂量组（4mg/kg）、澳洲茄边碱高剂量组（8mg/kg）。从第5日起，荷瘤对照组隔日皮下注射生理盐水0.2mL，实验组隔日皮下注射相应浓度药液0.2mL。每天观察并记录裸鼠的进食、饮水、二便、毛发的光亮程度及精神状态等情况；隔日一次，用电子秤记录裸鼠的体重、游标卡尺记录瘤体的长径和短径，肿瘤体积=长径×短径2/2；第19天最后一次给药24h后将裸鼠眼眶静脉取血保留，将肿瘤剥出，称重。

1.5 Real-time quantitative PCR实验检测组织中ki-67表达用TRIZOL法提取组织中总RNA，使用分光光度法测定RNA浓度和纯度，按1μg的总RNA拟转录合成cDNA，以cDNA为模板扩增目的基因片段，基因引物序列见表1。按照Real-time quantitative PCR 试 剂 盒 说 明：2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ 10μL，上下游引物（10μM）各 0.8μL，cDNA 模 板 2μL，DEPC 水 6μL，ROX Reference Dye Ⅱ0.4μL，总反应体系为20μL。按照扩增试剂盒程序：预变性95℃，30s；PCR反应95℃，5s；60℃ 34s，退火40个循环，以GAPDH为内参，采用2-△△Ct算法计算相对基因表达量。

表1 PCR引物序列

1.6 静脉血中各类细胞因子的测定以ELISA试剂盒检测裸鼠静脉血中各细胞因子的含量。裸鼠血清的制备：眼眶静脉取血后置于离心机以3000r/min离心15min，去上层血清置于离心管，保存于-80℃冰箱备用。按ELISA试剂盒说明书步骤分别测量裸鼠血清中 IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TNF-α的含量。

1.7 统计学方法采用统计软件SPSS 22.0分析实验数据，数据以均数±标准差（ ）表示，经检验实验数据均具有方差齐性，两组数据比较用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，差异具有统计学意义的判定标准为P＜0.05。

2 结果

2.1 裸鼠生存观察接种4天后，各组裸鼠右侧腋下均长出米粒样质硬瘤体，接种7天后，各组瘤体生长速度明显加快，且裸鼠逐渐出现不活泼、行动迟缓、食欲不振、聚集、毛发脱落、无光泽等现象。对比各组裸鼠生存变化，其中，荷瘤对照组一般情况未见明显异常，澳洲茄边碱低剂量组一般情况较差，澳洲茄边碱高剂量组一般情况最差。实验中，无裸鼠因药物毒副作用而死亡。

2.2 瘤体体积及瘤重用游标卡尺测量瘤体的长径和短径，计算瘤体体积，见表2。给药前（第4天）各组瘤体体积基本一致，差异无统计学差异；分组给药后，各组瘤体体积大小关系为：高剂量组＜低剂量组＜荷瘤对照组。其中，第16天、第20天，高剂量组与荷瘤对照组瘤体体积差异有统计学意义（P＜0.05）；第20天，低剂量组与荷瘤对照组瘤体体积差异有统计学意义（P＜0.05）；第16天、第20天，高剂量组与低剂量组瘤体体积差异有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组裸鼠皮下瘤体体积（ ，n=12）

接种20天，最后一次给药24h后，将裸鼠肿瘤剥出，称重，见表3。澳洲茄边碱给药组瘤重明显小于荷瘤对照组（P＜0.05），且高剂量组瘤重小于低剂量组（P＜0.05）。综上提示，澳洲茄边碱能够抑制CNE-1肿瘤细胞体内增殖，且呈浓度依赖性。

表3 各组裸鼠瘤重（ ，n=12）

2.3 组织中ki-67mRNA表达Real-time quantitative PCR结果显示，各组裸鼠肿瘤组织中ki-67mRNA表达比较：高剂量组＜低剂量组＜荷瘤对照组，给药组与荷瘤对照组表达的差异具有统计学意义（P＜0.05），高剂量组与低剂量组表达的差异未见统计学意义，见表4。

表4 各组裸鼠肿瘤组织中ki-67mRNA表达（ ，n=6）

2.4 静脉血中IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TNF-α含量接种20天，最后一次给药24h后，裸鼠眼眶取静脉血，ELISA试剂盒检测IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、IL-13、TNF-α含量，见表5。与荷瘤对照组相比，澳洲茄边碱给药组静脉血中IL-4、IL-6、IL-10、IL-13细胞因子含量降低（P＜0.05）；IL-12、TNF-α细胞因子含量增加（P＜0.05）。

表5 各组裸鼠外周血相关细胞因子含量（ ，n=6）

3 讨论

中药龙葵是茄科植物龙葵干燥地上部分，味苦、微甘，性寒，因有清热解毒、消炎利尿、消肿散结等功效，多用于治疗疮疖肿痛、小便不利、肿瘤等。研究发现，龙葵能够抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞凋亡、干扰细胞周期等，已用于治疗肝癌、宫颈癌、结肠癌、乳腺癌、口腔癌等［3-4］。澳洲茄边碱是一种天然甾体类生物碱糖苷化合物和细胞毒性剂，提取自龙葵，在肿瘤生长、转移、凋亡等环节发挥重要作用。Liang C H等研究发现澳洲茄边碱能增强肺癌细胞对TNFs的敏感性［5］，在白血病细胞中可通过激活溶酶体、线粒体途径诱导细胞凋亡［6］，可激活 AMPKα/NF-κB/MUC1抑制前列腺癌细胞生长［7］。澳洲茄边碱的抗肿瘤特性成为近年来研究热点。

在肿瘤微环境影响下，外周血单核细胞迁移浸润到肿瘤组织中，逐渐分化形成肿瘤巨噬细胞TAMs，目前发现TAMs与结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、甲状腺癌等多种肿瘤的发生发展密切相关［8-9］。受肿瘤细胞和肿瘤微环境的影响，大多数TAMs呈现类M2型巨噬细胞的免疫特性，而M2型巨噬细胞具有免疫抑制和促进肿瘤发展的作用［10］。研究表明，TAMs能够促进肿瘤生长、血管生成、肿瘤基质重塑和免疫抑制等，并且与肿瘤患者不良预后相关［11］。TAMs表型保留极化可塑性的能力，在肿瘤微环境细胞因子的影响下，可由免疫抑制表型M2转化为M1型，而与M2型不同，M1型巨噬细胞具有高度杀菌和抗肿瘤特性，能够激活机体特异性免疫应答。TNF-α、IL12等Th1细胞因子富集时，可诱导形成M1型巨噬细胞；IL-4、IL-6、IL-10、IL-13等Th2细胞因子富集时，可诱导形成M2型巨噬细胞［12-13］。因此，通过改变肿瘤微环境中细胞因子表达量，将TAMs由M2型转化为M1型，进而抑制肿瘤细胞生长发展。

ki-67细胞核抗原在细胞有丝分裂的G1期、S期、G2期和M期均有合成，因此，ki-67增殖指数是反映肿瘤细胞增殖的重要指数［14］。体内实验发现，澳洲茄边碱能够以浓度依赖性抑制裸鼠移植瘤瘤体体积和重量，在分子层面能够下调ki-67mRNA表达，表明澳洲茄边碱能够抑制CNE-1鼻咽癌细胞增殖。进一步探索其机制发现，澳洲茄边碱能够下调 IL-4、IL-6、IL-10、IL-13等Th2细胞因子表达，上调TNF-α、IL12等Th1细胞因子，表明澳洲茄边碱通过逆转TAMs表型，抑制细胞增殖。