雾化吸入灭活草分枝杆菌对脓毒症急性肺损伤大鼠精氨酸甲基转移酶—1表达的影响

齐心欣　顾忠民　陈超

【摘要】 目的：观察脓毒症肺损伤大鼠肺组织精氨酸甲基转移酶-1（coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1，CARM-1）、核因子-kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）、高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1，HMGB1）、血清降鈣素原（procalcitonin，PCT）的水平，探讨雾化吸入灭活草分枝杆菌治疗脓毒症肺损伤机制。方法：选取48只清洁级健康雄性Wistar大鼠随机分成假手术组（Sham组）、脓毒症肺损伤组（CLP组）、草分枝杆菌F.U.36注射液雾化吸入治疗组（F.U.36组），每组16只，于术后24、48 h分别检测HMGB1、PCT浓度及免疫组织化学检测CARM-1、NF-κB表达，光镜观察肺组织病理变化。结果：CLP组术后48 h死亡2只，F.U.36组术后48 h死亡1只，Sham组无死亡；CLP、F.U.36组术后24、48 h时的PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB浓度均高于Sham组，比较差异均有统计学意义（P<0.01）；F.U.36组术后24、48 h时的PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB浓度均显著低于CLP组，比较差异均有统计学意义（P<0.05）；光镜下CLP组和F.U.36组可见肺损伤，CLP组较F.U.36组损伤明显。结论：雾化吸入灭活草分枝杆菌可降低脓毒症肺损伤时相关炎症因子水平，对肺有保护作用。

【关键词】 灭活草分枝杆菌； 脓毒症； 肺损伤； 精氨酸甲基转移酶-1

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2018.16.080 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2018）16-0-03

脓毒症常引起急性肺损伤，其临床病死率高，目前认为与多种炎症介质有关，但发病机制仍未明确[1]。精氨酸甲基转移酶-1（coac-tivator-associated arginine methyltransferase 1 CARM-1）是蛋白质精氨酸甲基转移酶11个家族成员之一，目前发现其与心血管、呼吸等多种疾病有关[2]，但其在脓毒症肺损伤中的作用未见报道。研究认为草分枝杆菌（Mycobacterium phlei，M.ph）细胞壁、多糖等成分有免疫调节功能，草分枝杆菌F.U.36注射液作为灭活M.Ph制剂，目前已应用于临床[3]，但其是否可减轻脓毒症肺损伤，目前未见报道。故笔者通过实验比较脓毒症肺损伤大鼠雾化吸入草分枝杆菌F.U.36注射液后，肺组织CARM-1、核因子-kappa B（nuclear factor kappa B，NF-κB）、高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein box-1，HMGB1）及血清降钙素原（procalcitonin，PCT）的水平变化，探讨其减轻脓毒症大鼠肺损伤机制。

1 材料与方法

1.1 一般材料

48只清洁级健康雄性Wistar大鼠，体重（190±20）g（上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号：SCXK沪，2012-0002），利用随机数字表获取随机数字，按1∶1∶1随机分三组，即假手术组（Sham组）、脓毒症肺损伤组（CLP组）、草分枝杆菌F.U.36注射液雾化吸入治疗组（F.U.36组），每组16只。

1.2 试剂及仪器

草分枝杆菌F.U.36注射液（成都金星健康药业公司，规格1.72 μg/支），大鼠CARM-1、NF-κB及DAB试剂盒（北京中杉金桥生物技术公司），大鼠HMGB1及PCT试剂盒（上海酶联生物科技公司），10%水合氯醛溶液及10%甲醛溶液（上海江莱生物公司），空气压缩式雾化吸入治疗器（广东粤华医疗器械厂，型号WH-2000），电动玻璃匀浆器（宁波新芝，型号DY89-1），离心机（常州市万丰仪器制造有限公司，型号TD5A），酶标仪（美国AWARENESS公司，型号Stat Fax 2100），石蜡切片机（浙江金华益迪试验器材，型号YD-315），光学显微镜（厦门麦克奥迪公司，型号BA-210T）等。

1.3 方法

1.3.1 给药方法 参考Carpenter等[4]实验并予改进：将大鼠置入除底盖的矿泉水瓶中，露头于瓶颈外，尾端封上；向雾化器药杯中加人5 ml生理盐水（CLP组和Sham组）、草分枝杆菌F.U.36注射液（按照60 kg体重成人用量1.72 μg换算成大鼠等效剂量0.172 μg/kg，稀释于5 ml生理盐水）（F.U.36组），将雾化器给药管扣住大鼠口鼻雾化，直至药液雾化完，约需30 min[4]。各组雾化1次/d，连续雾化5 d。

1.3.2 模型制作 各组大鼠在最后一次雾化结束后24 h行脓毒症造模，参照Hubbard等方法：CLP组和F.U.36组予10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射麻醉，于腹正中做长2 cm的手术切口进入腹腔，将盲肠拉出，丝线结扎盲肠中段，扎线下0.5 cm处用国产25号针头穿透肠壁1次，形成漏口两处，挤压粪便流出，将盲肠回纳，逐层缝合关腹[5]。Sham组同法麻醉后开、关腹，不予盲肠结扎穿孔。三组术后均皮下注射平衡液50 ml/kg，术后正常饮水、进食。

1.3.3 标本采集 术后24、48 h三组各取8只大鼠麻醉后开腹抽取腹腔动脉血1 ml，待自然凝固后于1 h内3 000 r/min离心15 min，分离上层血清置-80 ℃冰箱保存待测PCT；开胸腔，完全分离肺部，取80mg肺组织制成匀浆，3 000 r/min离心15 min后分离上清液置-80 ℃冰箱保存以测HMGB1；取部分肺组织迅速放入10%甲醛溶液中固定，常规脱水、石蜡包埋切片以待免疫组织化学检测CARM-1、NF-κB和病理检查。

1.3.4 观察项目与检测方法 （1）大鼠肺组织HMGB1及血清PCT浓度测定：严格按照各试剂盒说明书要求，采用ELISA方法检测。（2）大鼠肺组织CARM-1、NF-κB免疫组织化学检测：取肺组织石蜡切片，予脱蜡、热修复抗原，孵育一抗，4 ℃过夜，孵育二抗，DAB显色，各级酒精（60-100%）脱水，封片，光镜观察免疫组织化学反应的强度及分布；通过IPP6.0图像分析软件，计算各组CARM-1、NF-κB的平均吸光度值（A值）。（3）大鼠肺组织病理学检查：取肺组织石蜡切片，脱蜡后行HE染色，在光学显微镜下观察肺病理结构改变。

1.4 统计学处理

采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

CLP组死亡2只（术后48 h死亡2只），F.U.36组死亡1只（术后48 h死亡1只），Sham组无死亡。死亡原因与脓毒症大鼠盲肠缺血坏死面积、腹腔渗出多、感染重等有关。

2.2 三组大鼠术后24、48 h PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB浓度比较

三组大鼠术后24、48 h PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB浓度比较差异均有统计学意义（P<0.05）。CLP、F.U.36组术后24、48 h时PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB浓度均高于Sham组，比较差异均有统计学意义（P<0.01）；F.U.36组术后24、48 h时PCT、HMGB1及CARM-1、NF-κB浓度均显著低于CLP组，比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.3 三组大鼠肺组织病理分析

Sham組大鼠肺组织结构完整，上皮细胞排列紧密，未见肿胀、坏死；CLP组可见上皮细胞排列紊乱伴坏死，大量炎性细胞浸润，肺泡内细胞渗出；F.U.36组上皮细胞变性坏死程度较轻，炎性细胞浸润相对较轻，肺泡渗出较轻，见图1、图2。

3 讨论

研究证实灭活M.Ph及其活性组分通过模式识别受体信号通路，影响免疫细胞功能基因表达[3]。相关研究提示雾化吸入草分枝杆菌F.U.36可改善支气管哮喘气道炎症反应[6]，其具有用药剂量小、副作用少等特点，而是否减轻脓毒症肺损伤反应目前未见报道，故本实验予以探讨。

PCT已成为脓毒症诊断指标之一，近来研究提示其与严重感染的脏器功能障碍程度相关[7]。本研究发现CLP组PCT水平明显增高，同期肺组织病理损伤明显，提示血清PCT水平高低反映出脓毒症肺损伤病情。F.U.36治疗组PCT水平较CLP组显著下降，肺部损伤较轻，提示雾化吸入草分枝杆菌F.U.36可下调其水平而减轻脓毒症肺损害。

研究认为胞外HMGB1可激活多种炎性细胞，加重组织坏死，是脓毒症重要的晚期炎症因子[8]，但其在脓毒症肺损伤中的作用研究极少。本研究发现CLP组HMGB1水平显著上升，同期肺病变严重，提示其参与了脓毒症肺损伤过程。目前认为HMGB1阻断疗法能减轻败血症、缺血再灌注损伤等疾病模型病情，可能成为治疗炎症和自身免疫疾病新方向[9]。本研究发现草分枝杆菌F.U.36可下调HMGB1水平从而改善肺部病情。

CARM-1在胞内信号转导、转录因子调控、细胞凋亡等方面发挥重要作用，目前研究发现其在支气管哮喘、肺癌等疾病的发展中扮演重要角色[10]。研究发现CARM-1是NF-κB激活的必需因子，其启动了胞内NF-κB信号传导通路，促进炎性基因表达[11]。本实验发现CLP组CARM-1及NF-κB水平明显增高，同期肺病变明显，提示二者参与了脓毒症肺损伤过程。F.U.36组二者水平有明显下降，肺部病变较轻，提示草分枝杆菌F.U.36可下调其水平而减轻脓毒症性肺损害。

研究发现HMGB1通过与TLR4结合，激活下游NF-κB诱导各种炎症因子的释放，NF-κB为重要的早期炎性因子，其与晚期炎性因子HMGB1在脓毒症的发展过程中存在正反馈机制[12]。本实验观察到CLP组HMGB1因子和信号通路蛋白CARM-1及NF-κB浓度明显增高，提示脓毒症时相关因子协同促进了肺损伤过程，而草分枝杆菌F.U.36通过降低相关因子水平减轻了脓毒症肺损伤。

本研究提示脓毒症急性肺损伤时，血清PCT、肺内HMGB1等炎症因子水平增高，肺内CARM-1、NF-κB等炎症信号传导因子表达增强，提示相关因子参予了脓毒症肺损伤过程，炎症因子与通路蛋白间存在正反馈关系。雾化吸入灭活草分枝杆菌通过降低脓毒症相关炎症因子及通路蛋白水平而起到减轻肺损害作用。

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（收稿日期：2017-12-28）