食用菌中多酚抗炎功能研究进展

张啸怡,李忠海,任佳丽

(中南林业科技大学食品科学与工程学院,稻谷及副产物深加工国家工程实验室,湖南长沙 410004)

食用菌不仅因其鲜美的味道受到人们的青睐,而且具有多种生物医学功能,如抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗心血管疾病、抗细菌、保肝、解毒、抗糖尿病和其他很多的生理功能[1-3]。我国食用菌的产量十分丰富,在2013年已经达3169.7万吨,占到了全球总产量的70%以上[4],因此受到广大研究者的青睐。在近年的报道中,发现食用菌含有许多具有抗炎作用的生物活性物质,包括多糖[5]、酚类[6-9]、倍半萜类、甾醇类[10-11]等。尽管许多物质可能参与到抗炎作用中来,但酚类很大程度上被看作有抗炎作用的主要自然物质,不同食用菌提取物中的总酚含量与抗炎效果之间是正相关的[12-13]。酚类物质是菌类产生的具有生理功能的次生代谢产物,酚酸虽然是酚类中含量最为丰富的分支,但是它们的提取物中的含量与抑制炎症的能力并不相关,这意味着酚类中的其它物质在抗炎中起到了关键的作用,Carlos Moro认为可能是焦倍酸在其中起着了关键作用,而其它的包括酚酸和黄酮在内的其它多酚类物质可能与其有协同作用[7]。但这与Oludemi Taofiq等[6]在得出的结论肉桂酸等具有较好的抗炎效果相悖。对食用菌中酚类具体何种物质的具有较强的抗炎作用或该物质与其他酚类的协同作用的研究,可以促进我们对食用菌中的多酚抗炎机制的认识,并为开发具有抗炎功效的食用菌保健食品提供理论支撑。

1 多酚及其提取纯化分离

多酚类物质指的是一类至少存在一个六元环而且存在一个或多个羟基官能团的物质[14]。多酚大体上可分为两大类:一大类是多酚单体,另一大类则是由单体聚合而形成的低聚或多聚体[15]。多酚的提取主要采用溶液萃取法。食用菌中的多酚提取可以采用的溶剂有很多的选择:甲醇、乙醇、乙酸乙酯、水等,Taofiq等[6]在对比各种不同溶剂的食用菌提取物的抗炎活性的影响后发现由乙醇作为提取剂提取出来的物质的抗炎活性较甲醇高,且乙醇价格也较为合理。为了提高提取的效率和缩短提取的时间,经常采用超声波辅助提取或微波辅助提取以达到最佳效果。在多酚纯化过程中,由于多酚类物质有较大的极性,较差的稳定性,且易氧化,因此很少用到正向硅胶分离纯化,一般采用以凝胶、树脂等柱色谱法来分离多酚[16]。要分离多酚类化合物,一般需采用半制备的高效液相色谱(HPLC),半制备的HPLC色谱分离结果较好。

2 炎症机理

炎症是生物从机体移除有害毒素或者病原体的重要的生物反应。在炎症反应中,巨噬细胞,单核细胞和其他一些炎性细胞分泌炎症因子。它们是特殊的细胞,通过吞噬作用来消化细胞残骸、细菌和癌细胞。它们在非特异性主动防御中有极其重要的作用,而且也可以激活其他防御机制。吞噬细胞除了激活免疫系统外还在炎症的响应中有极为重要的作用,他可以通过释放各种因子来促发炎症。当炎性细胞被暴露在脂多糖或病毒蛋白时,它们受到刺激而促使这些炎症因子的产量上升[17]。实验中一般采用脂多糖来诱导巨噬细胞,使其炎症因子分泌增多,根据提取物质对炎症因子的影响,便可得到该物质的抗炎活性。炎症的作用的信号通路图1如下,在巨噬细胞膜上的受体,Toll样受体4(TLRs4)和TNFR受体识别脂多糖(LPS)和肿瘤致死炎症α(TNF-α)[18-19],LPS和TLR4之间的互相作用导致髓样分化因子88(MyD88)和TRIF信号通路的激活,TNF-α与TNFR的相互作用导致TRAF信号通路被激活[20-22]。当这些信号通路被激活后,它们能够激活IKK激酶(IKKα、IKKβ、IKKγ)。IKK激酶进一步的使NF-κB复合物磷酸化导致IκB上的Lys48发生多聚泛素化[23],从而进一步的被蛋白酶体降解,当IκB降解后,导致NF-κB从复合物中分离出来,此时的NF-κB能转运到核内,然后连接到特殊的DNA序列上来编码促炎因子(IL-1、IL-2、IL-6、TNF-α)以及产生次级炎症介质的酶,如环氧酶-2(COX-2)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)等。iNOS催化L-精氨酸(L-Arg)产生信号分子NO,NO调节着炎症级联反应中的许多步骤,特别是在在炎症的发生和信号转导[24]。NO通过Ca离子通道来诱导心血管系统中心血管舒张,并且诱导神经系统细胞的死亡[25]。NO作为炎症因子,由于其测定想多的较为方便,经常在被用来作为检测物质抑炎作用程度[3,6,7,25-28]。一些多酚已经被证实抑制特定的步骤导致抑制NF-κB的释放,从而在炎症因子相对于的基因的表达减少,炎症因子分泌减少[29]。

图1 核因子-kB(NF-kB)途径示意图Fig.1 Schematic diagram of nuclear factor-kB(NF-kB)pathway

3 食用菌中多酚的抗炎功能

植物和食用菌均能够制造很多的次生代谢产物,而多酚类是这些产物中最重要的组分之一。它在抗炎方面的生理功能也越来越受到重视,表1展示了近些年来一些从食用菌中分离出来的酚类或其衍生物具有抗炎活性的依据。

表1 各种食用菌中酚类物质及其衍生物的抗炎作用Table 1 Phenolic compounds and derivatives isolated from mushrooms with reported anti-inflammatory potential

双胞蘑菇又称白蘑菇、蘑菇、洋蘑菇,欧美各国生产经营者常称之为普通栽培蘑菇或纽扣蘑菇。双孢蘑菇是世界性栽培和消费的菇类。Kohno等[30]发现从双孢褐色蘑菇中提取出来的2氨基-3H-吩恶嗪-3-酮(APO)具有抗炎活性。经过促炎症因子LPS/IFN-γ刺激的小鼠腹腔巨噬细胞后,APO抑制NO的产生的半抑制浓度IC50=1.5 μmol/L,而其对前列腺素E2(PGE2))的半抑制浓度IC50=0.27 μmol/L,数据分析显示APO对环氧合酶-1(COX-1)和环氧合酶-2(COX-2)酶的活性的抑制有相近的选择性。

牛樟芝是台湾特有的真菌,仅生长于台湾特有的牛樟树上。一些从牛樟芝中分离的苯型烃类及其衍生物已经测定具有抗炎活性[9]。从牛樟芝中分离的三种苯型烃类化合物能够抑制经过LPS刺激处理过的巨噬细胞分泌的NO的产生,这三种化合物是3-异丙烯-2-甲氧基-6-甲基-4,5-亚甲二氧基-酚、4,4′-二羟基-3,3′-二甲氧基-2,2′-二甲基-5,6,5′,6′双亚甲基脱氧联苯、2,3-亚甲二氧基-4-甲基-5-甲酚,他们的IC50分别是(1.8±0.2)、(18.8±0.6)、(0.8±0.3) μg/mL。其他从牛樟芝中分离出来的酚类因有较好的抗炎效果[31],能够抑制NO和PGE2的产生,并能在转录和翻译的水平上抑制iNOS和COX-2的表达。

粒状大团囊菌是子囊菌纲,曲霉目,大团囊科的一种使用真菌。在对粒状大团囊菌子实体的乙醇提取物的研究中发现当提取物浓度为50 μg/mL时,其对COX-2的抑制程度达到了68%。

通过生物活性追踪发现与之相关且被证实的两种活性物质分别为丁香醛和丁香酸,丁香醛对COX-2的半抑制浓度IC50=3.5 μg/mL,丁香酸对COX-2的半抑制浓度IC50=0.4 μg/mL[32]。

淡黄木层孔菌是一种药用蘑菇,属于刺革菌科真菌,其生长周期短,一般在3个月作用。Chang,Gebru等[33]用乙酸乙酯提取淡黄木层孔菌发现提取物对LPS诱导产生的NO和COX-2 mRNA的表达有较强的的抑制作用。6种被认证的主要产物中原儿茶醛起到了主要的作用。

栎迷孔菌,属多孔菌科一种,是木栖腐生的中小型菇类,该菇类生长于如台湾等地低中海拔林区。其具有抗炎作用,从其菌丝体提取的物质经过生物导向分离得到的物质的结构式为(-)-(2S)-2-羟甲基-2-甲基-6-羟基苯并吡喃。该成分在很小的浓度下就具备较高的抗炎活性,能有效的抑制COX-2的产生[34]。

洁丽香菇,来源为为侧耳科植物洁丽香菇的全草,具有补益气血的功效。在研究洁丽香菇的次生代谢产物的生理活性时发现了两种新的次生代谢产物[35],5-甲氧基苯并呋喃-4,7-二酮和1,3-二氢泵并呋喃-4,6-二醇,还有苯醌衍生物一种和6种肉桂酸的衍生物。5-甲氧基苯并呋喃-4,7-二酮对NO的半抑制浓度IC50=6.2 μg/mL。

Taofiq等[6]研究双孢蘑菇、平菇、松乳菇等十四种野生食用菌的乙醇提取物的抗炎活性,发现提取物活性成分化学特征上是酚酸或与其相关的物质。这些物质是对羟基苯甲酸、对香豆酸、和肉桂酸以及它们糖基化和甲基化的衍生物,并且发现通过化学合成的这些物质同样具有相对性的活性。平菇、高大环柄菇、黄褐牛肝菌、双孢蘑菇提取物的抗炎活性较高,其半抑制浓度从(96±1)～(190±6) μg/mL。

Moro等[7]研究双孢蘑菇、鸡油菌、松乳菇等6种食用菌,发现其提取物中抗炎活性较高的物种有双孢蘑菇、鸡油菌、松乳菇具有较高的抗炎活性,这几种菌能够抑制NO的产生,也能抑制iNOS、IL-1β和IL6 的mRNA的表达。

4 多酚抗炎研究方法

4.1 NO的检测方法

NO是炎症反应与免疫调节的效应因子,同时也是关键的调节因子。NO参与到各种炎症信号的传导,与各种炎症因子之间存在着相互作用。NO在炎症反应进程中的各个阶段都有产生,因此,可以测定细胞内NO的含量来判断某一研究的物质是否具有抗炎活性,固Griess反应被广泛运用在定量的测定NO上[24]。这个基本的反应涉及到磺胺和N-(萘基)乙二胺(NED)来组成稳定的偶氮物质。这个物质的吸光度在540 nm,在该波长处样本中的亚硝酸盐浓度呈正比。许多体外测定经过LPS刺激RAW264.7细胞产生的NO已被证实[6,37-38]。NO的电化学氧化产物NO+是能被还原的,正反应:NO-e→ NO+逆反应:NO++e→NO,因此我们能够使用电化学的方法来测定细胞和溶液中的NO的含量[39]。其中有两种较为实用的电化学方法:Clark电极法[40]的原理是利用小分子NO易被氧化的特性,使其在电极表面氧化产生电流,此电流可用安培表测出,而在体外一个小范围内(1～3×10-6mol/L),电流与NO浓度呈线性比例关系。该方法可以用于检测局部组织产生的NO,灵敏度较高(10-9mol/L),反应速度快(几秒钟)。其缺点是空气中的氧也能参与到反应中,从而对NO生成的电流信号的真实性产生干扰;聚合卟啉微感器法[40-41]是将卟啉化合物沉积在玻碳上,卟啉环内结合有金属离子Ni(II),NO与卟啉环中的Ni(II)配位,导致膜电位发生改变,从而可以由此测得NO含量。该法检测NO阈值可达10～20 mol/L,线性反应浓度高达3×10-4mol/L,其特异性也很高,可以测定单独一个细胞所产生的NO的量,该方法最适合用于测定NO释放的动力学的研究。用电化学这种方法的特点就是它可以在原位直接检测活体样本的NO,并且能够实现实时监控测定。检测细胞NO的产生是非常简便及高效的方法,经济实用,但通常需与其它指标一起检测来达到验证效果。

4.2 酶联免疫吸附剂实验(ELISA)法

ELISA法是用来检测和量化细胞分泌或释放的蛋白的一种方法,经常被用在测定抗炎活性中,用来测定炎症因子的含量,如白介素(IL-1β、IL-6、IL-8)和肿瘤致死因子(TNF-α)就可通过该方法测定出来[28,42-43]。通常将培养RAW264.7细胞的上清液收集起来,根据ELISA试剂盒产商提供的操作流程来检测上述炎症炎症的含量。这种方法利用保持其免疫活性的抗原或抗体结合到某种固相载体表面,然后与某种特定的酶连接形成酶标抗原或抗体,它同时保留了免疫活性和酶的活性。在测定时,把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。将固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质用洗涤的方法将其分开,最后如果结合在固相载体上的酶量越多,那么表示待测标本中受检物质的量也越多。在其中加入与作用的底物后,底物就可被酶催化变为相应的有色的产物,可以根据颜色的深浅作定量的分析。酶可非常大地放大反应效果,因此使用ELISA能有很高的敏感度[44]。ELISA法灵敏度较高,能探测到不同炎症因子的量的变化,能有效的验证抗炎活性。

4.3 实时荧光定量反转录PCR(RT-qPCR)法

提取组织或细胞中的总的RNA,以炎症因子iNOS、TNF-a、IL-1β和IL-6基于其表达的mRNA作为模板,采用Oligo(dT)或者随机引物,然后利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行扩增,从而获得检测基因表达。RT-PCR是可以定性的,但并不能进行定量检测的,而RT-qPCR 就是结合了荧光定量技术的RT-PCR,先从 RNA 反转录得到 cDNA(RT),然后再用 Real-time PCR进行定量分析(qPCR)。尽管该方法可达到快速、敏感和准确的量化,但不同控制条件下的分析必需采用可靠的方法[45]。

4.4 机体水平的实验法

在动物实验模型中毛细肿胀,血压升高,水肿这些现象与人类严重的炎症时的现象类似[46]。动物体内诱导的炎症发生的程度与肿胀呈正相关,机体水平的实验一般采用小鼠作为实验对象。在小鼠机体炎症机理的研究中基本上用到二甲苯诱导的小鼠耳肿胀法[47]、卡拉胶诱导的小鼠腹腔炎法[48]、大鼠棉球肉芽肿法这三种方法。小鼠耳肿胀法是先将多酚给予小鼠灌胃一段时间后,用等量的二甲苯涂于小鼠右耳(二甲苯有诱导小鼠肿胀功能),左耳对照,处理一段时间后,用打孔器取中央位置称其重量,左右耳的重量差值就是肿胀度;卡拉胶诱导小鼠腹腔炎法同样先将所研究物质(阳性对照为吲哚美辛)灌胃小鼠处理一段时间后,再注射卡拉胶生理盐水,处死老鼠后用磷酸缓冲液洗涤腹腔,收集洗涤液,并测定其中白细胞的数量;大鼠棉球肉芽法是先将大鼠麻醉后将一定量的无菌棉花球塞入大鼠两侧腋下,大鼠服用一定时间多酚(阳性对照为吲哚美辛)后,取出棉球,除去脂肪组织,将棉球烘干测定其重量。机体水平的实验能够更加直观的认证细胞水平抗炎效果。

3 结语

食用菌广泛分布于全世界,营养价值高,且中国是全球最大食用菌生产地,发展潜力巨大。多酚是广泛存在于食用菌中含量和种类丰富的一种次生代谢产物,其具有重要的抗炎功能。大量文献都指出从食用菌中分离得到的多酚具有抗炎活性,并且某些食用菌中分离出的多酚的半抑制浓度仅仅只有几微克每毫升,就能达到显著的抗炎效果。通过对炎症信号通路的解读,得知，炎症因子是炎症的最直观体现,炎症因子收到基因表达调控,因此细胞水平多酚抗炎研究方法就是对它们的含量变化进行检测,动物机体则是观察期形态变化。对于食用菌中具体何种多酚的抗炎作用说法不一,它们之间的相互作用更是几乎没有文献谈到。因此研究食用菌中多酚抗炎机制及它们之间的相作用具有重要意义。