水煮牛肉冷藏期间脂质和 蛋白质氧化与质构特性变化

彭珠妮,张雅玮,鲍英杰,任晓璞,朱玉霞,刘世新,彭增起

(南京农业大学食品科技学院,食品安全与营养协同创新中心,江苏南京 210095)

肉制品在冷藏期间由于氧化易引起肉品感官品质劣变。羔羊肉、鸡肉经过不同方式加热冷藏4 d的情况下,硫代巴比妥酸(TBARS)值、己醛含量、共轭二烯值等代表脂质氧化的指标均有相应的升高[1-2]。肉中的脂质氧化产物能够引起人体疾病,如动脉粥样硬化、胃肠病以及癌症等[3-4]。血红素铁(heme iron,HI)和非血红素铁(nonheme iron,NHI)作为肌红蛋白和血红蛋白的氧化产物,参与自由基链式反应形成脂质和蛋白质氧化产物,使肉品的氧化稳定性减弱[5]。外源添加肌红蛋白和非血红素铁促进牛肉、猪肉、鸡肉的脂质氧化,结果表明肌红蛋白相比于非血红素铁的促氧化能力更强,并且在牛肉中表现出最高脂质氧化水平[6]。最近研究主要通过体外脂质、蛋白氧化体系的建立来探讨血红素铁、脂质和蛋白质氧化之间的关系,缺少熟肉中血红素铁与脂质和蛋白质氧化的相关研究。

肉品中脂质氧化和蛋白质氧化存在相互促进关系,脂质氧化生成的活性和非活性自由基夺取蛋白的氢原子,生成蛋白自由基,引发蛋白质链式反应[7]。Soyer等[8]发现鸡的胸肌和腿肌在冷冻期间TBARS值、蛋白羰基值和游离巯基值之间具有很强的相关性,TBARS值、蛋白羰基值与游离巯基值呈负相关。加热处理提高牛肉蛋白羰基和席夫碱含量,降低蛋白中酪氨酸和色氨酸含量,牛肉的蛋白氧化程度加深[9]。肌原纤维蛋白经加热处理形成不可逆的凝胶结构,蛋白的二级结构趋于无序化,二硫键含量的上升与凝胶硬度呈显著正相关[10]。目前国内外的研究主要集中在生肉冷藏期间脂质和蛋白质氧化方面以及加热对蛋白凝胶的氧化方面,关于熟肉中脂质和蛋白质氧化的相关报道较少,这也是本文的出发点。

本文研究水煮加热的牛肉4 ℃冷藏0～5 d期间脂质和蛋白质氧化如何相互影响引起肉品质构的变化,非血红素铁和血红素铁对脂质和蛋白质氧化起到的作用,以期为控制熟肉制品冷藏期间肉品质变差提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

24月龄左右的黄牛背最长肌 购自南京市卫岗农贸市场;铁标准溶液 北京有色金属研究总院;亚硝酸钠、三氯乙酸、盐酸、焦磷酸钠、氯化钾、氯化镁、硫代巴比妥酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、二硝基苯腙、酸乙酯、乙醇、盐酸胍、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、Tris、赖氨酸、尿素 分析纯,国药集团上海化学试剂有限公司;5,5′-二硫双(2-硝基苯甲酸，DTNB)、血清蛋白、Tris-马来酸 分析纯，美国Sigam-Aldrichg公司。

TA-XT plus质构仪 英国Stable Micro System公司;YP1201N电子天平 上海精密科学仪器公司;ZKSY-420水浴锅 南京科尔仪器;IKAT18basic型高速匀浆机 德国IKA有限公司;DU730型紫外-可见分光光度计 美国Beckman Coulter有限公司;Allegra 64R型高速冷冻离心机 美国Beckman Coulter有限公司;Hanna-211型pH计 意大利Hanna有限公司;Varian SpectrAA 40型原子吸收仪 澳大利亚Mulgrave Victoria公司。

1.2 实验方法

1.2.1 水煮牛肉样品制备 背最长肌剔除可见筋膜和脂肪,沿着牛肉肌纤维方向切成1.5 cm×1.5 cm×2.5 cm长条状,肉条放置于盛水(水的温度与水浴锅中水温度相同)的聚丙烯容器中,88 ℃水浴加热至肉中心温度(80±1) ℃,立即捞出冷却至室温25 ℃左右,放入透气的自封袋,根据熟肉4 ℃条件下的保鲜周期和熟肉较高的氧化速率选择冷藏0、1、3、5 d,测定相应指标。

1.2.2 总铁、非血红素铁和血红素铁的测定 非血红素铁含量的测定参照Igene等[11]和South等[12]的方法稍作修改。称取1.0 g肉样加入10 mol/L缓冲液(20%三氯乙酸和3 mol/L盐酸)和40 μL 0.39%亚硝酸钠,将样品放入65 ℃水浴中孵化20 h,孵化完成后,样品冷却至室温,3600 r/min离心10 min。上清液中非血红素铁含量使用原子吸收分光光度仪分析。结果表示为mg/kg。肉中的总铁含量的测定根据国标GB/T 9695.3-2009[13]测定,并稍作修改。血红素的含量=总铁含量-非血红素含量。

1.2.3 TBARS的测定 TBARS的测定参照张露等[14]的方法。结果表示为mg 丙二醛(MDA)/kg肉样。

1.2.4 游离巯基(SH)的测定 根据Beveridge等[15]和Cui等[16]的方法,取5.0 g样品放入100 mL离心管中,加入45 mL pH7.4的焦磷酸缓冲液(2.0 mmol/L焦磷酸钠、10 mmol/L Tris-马来酸、100 mmol/L氯化钾、2.0 mmol/L氯化镁、2.0 mmol/L EDTA),以4000 r/min的速度匀浆60 s。添加2.5 mL的Tris-gly缓冲液(8 mol/L尿素溶液和0.02 mL 4 mg/mL的DTNB)于0.5 mL蛋白溶液。25 ℃水浴30 min,412 nm测定其吸光值。摩尔吸光系数采用13.6 L/(mol·cm)。巯基最终含量为每克蛋白质中所含微摩尔巯基含量,即ηmol SH/g蛋白。

1.2.5 蛋白羰基的测定 参考Armenteros等[17]的方法,取5.0 g样品放入100 mL离心管中,加入45 mL pH7.4的焦磷酸缓冲液(2.0 mmol/L焦磷酸钠、10 mmol/L Tris-马来酸、100 mmol/L氯化钾、2.0 mmol/L氯化镁、2.0 mmol/L EDTA),以4000 r/min的速度匀浆60 s。取2份0.5 mL均质液于10 mL离心管中,加入4 mL 10%的三氯乙酸溶液,5000 r/min离心5 min,去上清液,一组加入4 mL 2 mol/L HCl用于测定蛋白浓度,另一组加入4 mL 0.2%(w/v)DNPH(2 mol/L HCl为溶剂)用于蛋白羰基值的测定。20 ℃条件下振荡1 h,再加入4 mL 10% 三氯乙酸,摇匀后5000 r/min条件下离心5 min,去掉上清液,加入2 mL 1∶1(v/v)乙醇/乙酸乙酯,在5000 r/min条件下离心5 min,重复2次。去掉上清液,加入3 mL 20 mmol/L pH6.5的磷酸钠缓冲溶液,其中包含6 mol/L盐酸胍,振荡,5000 r/min离心5 min,去除不溶性成分后370 nm条件下测定羰基值。280 nm条件下测定蛋白浓度,用牛血清蛋白做标准曲线(y=0.0415x+0.063,R2=0.999)计算。蛋白腙的摩尔吸收系数为22000 M-1cm-1,蛋白羰基值含量表示为ηmol蛋白羰基/g蛋白。

1.2.6 质构的测定 参考张露等[14]的方法略有修改。水煮处理后的肉样修整为1 cm×1 cm×2 cm的长条状,采用质构仪对肉样进行两次轴向压缩,测定前速度5.0 mm/s,测定时速为1.0 mm/s,测定后速度5.0 mm/s。压缩比50%,触发类型为Auto,触发力为5.0 g。

1.2.7 剪切力的测定 参考丁武等[18]的方法略有修改。使用剪切仪测定剪切力。将生肉沿着与肌纤维平行的方向分割为1.5 cm×1.5 cm×2.5 cm的长条状,水煮后的熟肉修整为1 cm×1 cm×2 cm的长条状进行测量。测力传感器50 kg,十字头速度,150 mm·min-1。每组取样点设置3个重复,测定两次,结果用牛顿(N)表示。

1.3 数据与统计分析

所有数据采用SPSS 19.0软件进行统计分析,采用ANOVA进行邓肯(Duncan’s)差异分析,以p<0.05表示差异显著。使用皮尔逊相关系数(Pearson correlation coefficient)分析各指标之间的相关性。

2 结果与分析

2.1 水煮牛肉冷藏期间总铁、血红素铁、非血红素铁含量变化

从图1中可以看出,水煮牛肉的总铁含量维持在17.324～18.923 mg/kg,条例报告[19],牛肉中总铁含量在14～29 mg/kg。随着冷藏天数的延长,血红素铁含量不断下降,血红素铁0 d时含量为13.874 mg/kg,约占总铁含量的77%。血红素铁在第5 d时为9.382 mg/kg,约占总铁含量的52%。冷藏期间血红素铁不断转化为非血红素铁,非血红素铁含量0～5 d从4.571 mg/kg显著升高至7.942 mg/kg(p<0.05),相比于0 d升高74%。Dai等[20]的研究也表明随着冷藏时间的延长,非血红素铁含量显著上升,与本文研究结果一致。水煮牛肉条经过加热处理,肌肉蛋白发生自动氧化,球蛋白的结构被打开和破坏,弱化血红素和球蛋白之间的联系,不断释放出高铁血红素[21],高铁血红素继续参与氧化反应生成非血红素铁[22],因此随着冷藏时间的延长,血红素铁的含量逐渐降低,非血红素铁含量逐渐增加。

图1 水煮牛肉冷藏期间总铁、 血红素铁、非血红素铁含量变化Fig.1 Changes of the content of total iron,heme iron and nonheme iron in braised beef during chilled storage注:对于同一测定指标,小写字母不同代表 不同天数差异显著,p<0.05。

2.2 水煮牛肉冷藏期间脂质氧化的变化

从表1中可看出冷藏0～5 d后水煮牛肉中的TBARS值显著升高(p<0.05)。5 d时丙二醛的含量升至0.250 mg/kg,相比于0 d增加了18倍。说明水煮牛肉在冷藏期间脂质发生剧烈氧化。0～1 d阶段TBARS含量从0.013 mg丙二醛/kg升至0.092 mg丙二醛/kg,丙二醛生成速率最高,TBARS值与血红素铁呈极显著负相关(r=-0.909,p<0.01)。血红素铁在0～1 d阶段是水煮牛肉中铁离子的主要形式,其参与不饱和脂肪酸反应生成自由基,自由基参与脂质氧化链式反应,加快脂质氧化进程[23]。脂质氧化速率在0～1 d最高,可能是血红素铁促进了水煮牛肉的脂质氧化。

表1 水煮牛肉冷藏期间TBARS、游离巯基、蛋白羰基含量的变化Table 1 Changes of content of TBARS,free SH-group,protein carbonyl in braised beef during chilled storage

丙二醛的生成与非血红素铁呈极显著正相关(r=0.918,p<0.01)。随着冷藏天数的增加,水煮牛肉的脂质氧化程度加深。生成的脂质氧化产物如4-羟基-2-壬烯醛通过与肌红蛋白组氨酸残基共价结合,促进肌红蛋白氧化速率加快,不断生成非血红素铁,并提高脂质氧化的促氧化活力[24]。Sung等[25]的报道指出肌红蛋白氧化生成的血红素铁与脂质氢过氧化物反应不仅促进脂质氧化的进程,同时也破坏血红素铁的卟啉环结构,生成非血红素铁。冷藏后期丙二醛的生成速率下降,可能与水煮牛肉中血红素铁含量下降,非血红素铁含量上升有关。有研究将肌红蛋白添加到水洗肉中,突变处理后的肌红蛋白卟啉环结构更易降解,从而释放更多的非血红素铁,但脂质氧化的速率却降低[26]。说明相比于血红素铁的促脂质氧化能力,非血红素铁对脂质氧化的促进的效率更低。这可能是因为脂蛋白中血红素铁与脂质过氧化氢物反应生成的非血红素铁被运输到亲水相,阻止了铁与脂质接触[27]。

2.3 水煮牛肉冷藏期间蛋白质氧化的变化

水煮牛肉冷藏期间游离巯基和蛋白羰基含量变化如表1所示。屠宰后肌肉中的巯基总量基本保持稳定,含有巯基基团的氨基酸(半胱氨酸)易被氧化形成二硫键,因此常用游离巯基含量来反映蛋白质氧化程度。表1中表明游离巯基含量随着冷藏时间的延长呈下降趋势。在1 d时,游离巯基含量降低了19.08%,与0 d相比差异不显著(p>0.05),这与Dai等[20]和刘海梅[28]的研究一致。而在冷藏后期游离巯基显著下降(p<0.05),5 d时游离巯基含量仅为0 d的44.65%,说明蛋白氧化主要发生在冷藏后期,加热处理对二硫键的生成无显著影响。这与Lu等[29]的研究一致,冷藏期间游离巯基发生氧化主要生成二硫键。

蛋白羰基含量可间接反映蛋白氧化的程度。表1表明蛋白羰基值随着冷藏时间的延长而不断增加,1 d和5 d时蛋白羰基含量相比于0 d显著上升(p<0.05),冷藏5 d蛋白羰基含量上升为0 d时的2.67倍。1 d蛋白羰基含量显著上升的原因可能是水浴加热的时间较长,肉中的肌原纤维蛋白发生氧化反应形成羰基基团,并且终点温度和加热方法显著影响蛋白羰基含量[20]。而冷藏后期蛋白羰基值的升高可能是由于水煮牛肉中脂质氧化生成大量脂质二级氧化产物促进了蛋白质氧化进程[30]。

蛋白羰基值和TBARS值具有极强正相关性(r=0.909,p<0.01),半胱氨酸、精氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、色氨酸和组氨酸等残基的侧链容易受到一些氧化的脂类和其衍生物的作用而引发氧化反应生成羰基衍生物[31]。丙二醛作为脂质氧化的二级产物,可以与蛋白的多肽骨架及其边链发生氧化修饰,改变蛋白质构象[32]。除了脂质氧化产物和自由基直接攻击蛋白侧链和肽键生成蛋白羰基,蛋白参与的还原糖反应也生成羰基化合物。血红素铁会随着脂质氧化的进程而逐渐释放出非血红素铁,蛋白与还原糖反应生成席夫碱衍生物过程中的中间糖基化产物经过Amadori重排形成酮基衍生物,该衍生物对非血红素铁的氧化非常敏感,能够生成二羰基化合物[33]。

蛋白羰基值和非血红素铁含量的相关性极显著(r=0.918,p<0.01),非血红素铁是水煮牛肉冷藏期间促进蛋白质氧化的主要催化剂,它使肉品的氧化稳定性减弱,促进肉品中蛋白羰基值的上升。Eztevez[34]证明铁离子对肌原纤维蛋白质氧化生成蛋白羰基具有直接的促进作用。蛋白羰基的主要形式γ-谷氨酸半醛(AAS)和α-氨基乙二酸(GGS)的生成需要铁离子的存在[35]。铁离子介导的脂质氧化和蛋白质氧化存在先后顺序,研究无机二价铁离子Fe2+对肌红蛋白、油脂及肌原纤维蛋白三大肌肉组分氧化的影响。结果表明肌红蛋白优先于脂肪和肌原纤维蛋白开始氧化,脂肪经肌红蛋白氧化产物引发链式反应,在高浓度的铁离子下显示出较高的POV和TBARS值。脂质氧化先于蛋白质氧化发生,Fe2+作用下加剧肌红蛋白及脂质的氧化过程所形成的自由基可能进一步作用于肌原纤维蛋白,蛋白的游离巯基也随着铁离子的浓度增加而减少[36]。该结论与本实验得到的结论相似,非血红素铁含量随着冷藏时间的延长而增加,蛋白游离巯基的含量逐渐减少,二者为极显著负相关(r=-0.884,p<0.01)。肌红蛋白诱导的脂质氧化产生脂质衍生自由基能够氧化蛋白的巯基基团,使蛋白之间形成以二硫键为主的共价交联,削弱蛋白功能特性[24]。

2.4 水煮牛肉冷藏期间剪切力和质构特性变化

冷藏期间水煮牛肉剪切力和质构特性变化如表2所示。经过水煮加热处理的牛肉,其剪切力、硬度、胶粘性、咀嚼性等数值在冷藏期间均显著上升(p<0.05),并且在第5 d时达到最大值,与Ganhao等[37]的研究一致。粘附性、内聚性、弹性的数值在冷藏0～5 d期间未发生明显变化。水煮牛肉的质构变化主要与冷藏过程中水煮牛肉的化学组成,物理化学特性的变化有关,进而引起肉品的微观结构变化。牛肉冷藏期间水分含量减少可能是牛肉硬度值上升的一个原因。蛋白冷藏期间由于侧链氨基酸基团氧化生成蛋白羰基和共价键,部分蛋白失去功能性是导致水煮牛肉硬度上升的主要原因[38]。相关性分析表明,冷藏期间水煮牛肉游离巯基含量与剪切力(r=-0.926,p<0.01)及硬度(r=-0.716,p<0.01)呈现极强的负相关。水煮牛肉中游离巯基氧化产生的二硫键是稳定蛋白结构的重要化学键,生成适当含量的二硫键可以降低蛋白质的构象熵,使蛋白质达到稳定的结构和产生良好的热稳定性[39]。蛋白质氧化程度继续加深,过量二硫键形成会导致蛋白键的断裂以及肌原纤维蛋白结构的坍塌[40]。

表2 冷藏期间水煮牛肉剪切力和质构特性变化Table 2 Value of shear force and textural characteristic in braised beef during chilled storage

脂质和蛋白质的联合氧化首先从脂质氧化开始,并将活性脂质过氧化物、脂质氧化产物醛酮类和自由基等转移到蛋白质氧化链式反应中,最终形成蛋白质内外的共价交联[41]。Zhou等[36]发现丙二醛能够改变蛋白的结构,随着丙二醛添加量的增加(MDA≤10 mmol/L),蛋白羰基值呈线性增长,系水力提高,并且通过形成非硫共价键增强凝胶的网状结构;加热处理会增强蛋白质氧化交联,且加热过程中蛋白交联主要由二硫键引发。蛋白氧化通过改变蛋白质分子的变性、交联和聚集程度改变蛋白的溶解性,凝胶硬度值与蛋白溶解度呈极显著正相关,进而影响蛋白的凝胶质构[42]。

3 结论

水煮加热的牛肉冷藏期间血红素铁含量与TBARS值呈极显著负相关(r=-0.944,p<0.01),说明血红素铁可能是促进脂质氧化的重要物质,血红素铁含量随着脂质氧化程度的加深而不断降低,非血红素铁含量升高,可能是脂质氧化产物可与血红素铁反应,使卟啉环裂解释放出非血红素铁。非血红素铁与TBARS值(r=0.967,p<0.01)和蛋白羰基值(r=0.970,p<0.01)呈极显著正相关,说明脂质氧化产物和非血红素铁影响蛋白氧化,蛋白羰基值随着冷藏时间的增加而升高,游离巯基含量减少,二硫键等蛋白间或蛋白内的共价键增加致使硬度、剪切力等数值出现不同程度上升。本研究结果为控制水煮牛肉冷藏期间肉品质变差提供一定的理论依据。