产γ-氨基丁酸乳酸菌的筛选鉴定 及其紫外诱变研究

田 蕊,萨如拉,段晓霞,乌云达来

(内蒙古农业大学食品科学与工程学院,内蒙古呼和浩特 010018)

γ-氨基丁酸(Gamma-Amino-Butyric Acid,GABA)是一种存在于自然界的非蛋白氨基酸,又称氨酪酸,是人体中枢神经中重要的神经递质,是神经抑制性氨基酸,具有降血压[1]、改善和治疗糖尿病[2]、治疗癫痫[3]、抗癌[4]、抗疲劳、改善脑功能、增强记忆力[5,6]以及抗压等作用[7],是对人体起重要抑制作用的一种氨基酸[8]。随着年龄的增长,精神压力的加大使得人体自身积累GABA能力下降,而从日常的饮食中补充GABA则能有效的改善这种状况[9]。因此,研究富含GABA的功能性食品就显得尤为重要[10]。2017年周中凯等[11]对富GABA米糠与普通米糠进行对比,发现富GABA米糠能有效抑制大鼠过氧化水平,对肝损伤起到了一定的保护作用。

目前,GABA的生产方式有化学合成法、植物富集法以及微生物发酵法[12-13],化学合成法制备得到GABA转化率高、纯度高,但由于反应条件剧烈,且反应产物的安全性存在争议,故不常用于食品加工中[14]。目前植物富集法已经得到了广泛的应用,2014年边伟等[15]通过对桑茶进行研究，得到一株高产GABA的菌株，其GABA含量高达3.322 mg/g,且桑茶滋味品质较好。与植物富集法不能大量富集GABA,工艺复杂且成本高等缺点相比,微生物发酵法具有安全性高、操作简单、成本低、工艺简单等优点,使其在食品加工中得到更加广泛的应用[16]。研究表明,目前能够用于生产GABA的微生物包括大肠杆菌[17]、曲霉[18]以及乳酸菌[19]。其中乳酸菌作为一种对人体几乎无害的菌群,成为了人们争相研究的对象。20世纪80年代中后期,日本的科研人员发现鲜茶叶可以在厌氧的条件下积累大量GABA[20];2013年李亚莉等[21]在普洱茶发酵过程中添加优势菌种,使GABA产量提高3～25倍。微生物发酵法制备GABA的研究大部分以常见发酵食品为研究对象,例如:泡菜、发酵米粉[22]、酸菜[23]、豆乳[24]等。而具有调理肠道[25]、增强免疫力[26]、辅助治疗心血管疾病、肺部疾病以及消化道疾病等医疗保健作用的酸马奶[27],却极少得到人们的重视。

本实验对酸马奶中分离得到的17株乳酸菌进行筛选,得到一株产GABA菌株,对其进行生理生化及分子生物学鉴定,并对菌株进行紫外诱变进一步提高GABA产量,为今后实现GABA的功能性食品研究打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

试验菌株 供试菌株共17株(由内蒙古农业大学食品质量与安全教研室前期从酸马奶中分离的菌株);衍生化试剂PITC和γ-氨基丁酸(含量≥99%) 美国Sigma公司;乙腈、乙酸和三乙胺 色谱纯,天津市光复精细化工研究所;谷氨酸钠、无水乙酸钠、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖 分析纯,天津市大茂化学试剂有限公司;水为超纯水。

1260高效液相色谱仪 Agilent公司;ZHJHZ-C1214双人单面净化工作台 上海志诚公司;YM-50高压灭菌锅 上海博讯公司;5804R高速离心机、Eppendorf公司;2710PCR仪 ABI公司;FR980凝胶成像仪 上海复日科技有限公司;LRH-150系列恒温培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 培养基配制:脱脂乳培养基:脱脂乳粉10.0 g、酵母粉0.1 g、蒸馏水90 mL,121 ℃、7 min灭菌备用。

液体MRS培养基:柠檬酸二胺0.2%,酵母粉0.5%,葡萄糖2%,吐温-80 0.1%,牛肉浸膏0.5%,乙酸钠0.5%,磷酸氢二钾0.2%,蛋白胨1%,硫酸镁0.058%,硫酸锰0.025%,pH6.2～6.4,121 ℃,灭菌15 min。

固体培养基:液体MRS培养基基础上,加1%的琼脂,121 ℃,灭菌15 min[28]。

液体GYP培养基:酵母粉1%,蛋白胨0.5%,葡萄糖1%,醋酸钠0.2%,硫酸镁0.02%,硫酸锰0.0001%,硫酸亚铁0.0001%,氯化钠0.0001%,自然pH[28],121 ℃,灭菌15 min。

GYP发酵培养基:液体GYP培养基基础上加1%的谷氨酸钠,pH6.8[12],121 ℃,灭菌15 min。

1.2.2 产GABA菌种的筛选 将17株供试菌株接种于脱脂乳培养基活化1代后,接种于MRS液体培养基中活化2代,以4%的接种量接种于5 mL GYP发酵培养基中,置于37 ℃恒温箱、培养48 h。取出摇匀振荡,取5 mL发酵好的菌液,8000 r/min离心10 min,取上清液测定其GABA含量[29],从而筛选出GABA产量较高的菌株,并将其作为出发菌株进行生理生化及分子生物学鉴定。

1.2.3 供试菌株产GABA能力的测定 高效液相色谱法标准曲线的绘制:配制浓度为0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mmol/L的GABA标准溶液,准确吸取GABA标准溶液各200 μL分别置于1.5 mL离心管中;加入三乙胺乙腈溶液100 μL、PITC乙腈溶液100 μL至每个离心管中,混匀,室温放置(25 ℃)1 h;然后加入正己烷400 μL至每个离心管,振摇后放置10 min;取下层溶液(PTC-AA),用0.45 μm针式过滤器过滤;取滤液200 μL,加800 μL水稀释,摇匀,放入进样瓶中用高效液相色谱法进行GABA测定,每个浓度做两个平行样测定,根据测定结果以GABA浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制GABA曲线[12,30]。

样品GABA含量的测定:取200 μL 1.2.2中得到的发酵液根据上述衍生化方法处理后测定其GABA峰面积,并根据标准曲线计算样品中的GABA含量。

1.2.4 出发菌株生理生化及分子生物学鉴定

1.2.4.1 出发菌株生理生化鉴定 在37 ℃恒温培养48 h的MRS平板中挑取单菌落进行革兰氏染色,再对菌株进行生理生化实验,包括过氧化氢酶实验、吲哚实验、硫化氢实验、石蕊牛奶实验以及糖发酵实验[31]。

1.2.4.2 出发菌株分子生物学鉴定 根据基因组DNA提取试剂盒步骤提取菌株43的基因组DNA,用于16S rDNA的PCR扩增正向引物(P1):5′-AAGAGTTGATCCTGGCTCAG-3′;反向引物(P2):5′-CTACGGCTACCTTGTACGA-3′。50 μL反应体系:Mix 25 μL,模板DNA 1 μL,P1 2 μL,P2 2 μL,ddH2O 20 μL;PCR反应程序:94 ℃ 2 min;94 ℃ 45 s、55 ℃ 50 s、72 ℃ 2 min,30个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃延伸60 min。16S rDNA序列测序由上海生工生物技术公司完成。将菌株的16S rDNA序列与GenBank序列数据库中的标准序列进行BLAST同源性检索,再利用MEGA5.0软件采用邻接法构建系统发育树[31]。

1.2.5 紫外诱变筛选GABA高产菌株

1.2.5.1 菌悬液的制备 将出发菌株按4%的接种量接种于10 mL GYP发酵培养基中,培养至对数期,取出用振荡器摇匀后8000 r/min离心10 min,弃上清液,加生理盐水洗涤两次,再倒入10 mL生理盐水摇均后备用。

1.2.5.2 最佳紫外诱变条件的选择 将10 mL制备好的菌悬液放置在培养皿中置于黑暗条件下,选择30 W紫外灯进行诱变育种,在距离紫外灯30 cm处分别对其照射10、20、30、40、50、60、80、100 s,静置30 min,将紫外处理后的菌液进行梯度稀释至10-6、10-7、10-8后,涂布培养并计算致死率,选取致死率为80%～90%之间的时间为最佳诱变时间[23]。

致死率(%)=(诱变前的菌落总数-诱变后的菌落总数)/诱变前的菌落总数×100[32]

1.2.5.3 突变菌株的遗传稳定性研究 对筛选出的目的菌株进行连续传代培养10代,并对其发酵产物进行GABA含量的测定,观察其遗传稳定性[33]。

1.3 数据处理

利用SPSS软件对1.2.5筛选出的突变菌株以及GABA高产菌株的产GABA能力遗传稳定性代次之间的显著性进行分析。

2 结果与分析

2.1 GABA标准曲线的绘制

高效液相色谱法分辨率高于其他色谱法,重复性高、速度快、时间短,十几分钟到几十分钟就可完成,自动化程度高,分析精确度高[34-35]。其标准曲线如图1所示。

图1 γ-氨基丁酸标准曲线Fig.1 Standard curve of γ-aminobutyric acid

从图1可知,在GABA标曲浓度0.5～2.5 mmol/L之间,其线性方程为y=1665.7x-225.39,R2为0.9992,表明浓度与峰面积之间的线性关系良好。

对17株供试菌株进行产GABA菌株的筛选,最终得到一株具有产GABA能力较好的菌株43,其产量为0.731 g/L(见表1),故选择菌株43为出发菌株并对其进行生理生化及分子生物学鉴定。

表1 17株产GABA乳杆菌菌株测定结果Table 1 Result of 17 strains of GABA producing lactobacillus

2.2 出发菌株生理生化及分子生物学鉴定

2.2.1 出发菌株生理生鉴定 菌株43的生理生化实验结果如表2所示,菌株43为革兰氏阳性菌;接触酶实验、吲哚实验以及硫化氢实验均呈阴性;石蕊牛奶实验呈阳性,石蕊牛奶凝固且有乳清析出。菌株43 API 50 CH糖发酵实验结果见表3,将结果输入apiweb分析软件中进行鉴定,其鉴定结果为菌株43与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)的相似度为99.9%。结合表2实验结果,将菌株初步鉴定为植物乳杆菌。

表3 菌株43 API 50 CH糖发酵实验结果Table 3 API 50 CH results of sugar fermentation of strain 43

表2 菌株43生理生化实验Table 2 Physiological and biochemical properties of strain 43

2.2.2 16S rDNA扩增结果 菌株43 16S rDNA基因的PCR扩增结果见图2。

图2 菌株43 16S rDNA PCR扩增产物Fig.2 16S rDNA PCR amplification of stain 43

由图2可知,产GABA乳酸菌菌株43的16S rDNA基因序列在1000 bp左右出现了特异性荧光条带,其能满足后续的测序要求。

2.2.3 菌株43的序列比对及系统发育树的绘制 测序结果表明,出发菌株43的16S rDNA基因序列共计1470 bp,对其进行同源性分析可知其为植物乳杆菌,并与GenBank数据库中的已知的11株植物乳杆菌基因序列进行对比,并用MEGA5.0进行了系统发育树的绘制[31],如图3所示。结果表明出发菌株43与植物乳杆菌的同源性为95%,且处于一个分支上,由此进一步证明,菌株43为植物乳杆菌。

图3 菌株43的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain 43

2.3 紫外诱变筛选目的菌株

2.3.1 最佳紫外诱变条件的选择 紫外诱变时间与菌株43致死率的关系如图4所示,选择致死率在80%～90%的范围为最佳诱变时间[23],由图4可知,30、40 s的致死率分别为87%、90%,正突变率分别是33.3%和53.3%,根据正突变率最终选择40 s作为最佳诱变时间。

图4 紫外诱变致死率曲线Fig.4 Lethality curve of strain 43 under UV mutagenesis

2.3.2 紫外诱变结果 以菌株43为出发菌株进行诱变,在距离30 W紫外灯30 cm处诱变40 s,进行7轮的紫外诱变处理,经初筛选出28株突变株进行复筛,其中5株产GABA的含量较高,结果由表4可知,菌株43-48与原始菌株43无显著差异(p>0.05),菌株43-18与显著高于菌株43(p<0.05),而其他43-3、43-7、43-23三株菌株的GABA产量极显著高于菌株43(p<0.01),其中43-7的产量最高,为1.051 g/L,比原始菌株的GABA产量提高了43.6%。

表4 突变菌株发酵液中GABA 产量Table 4 GABA production in mutant strains broth

2.3.3 突变菌株的遗传稳定性研究 对GABA高产菌株43-7进行遗传稳定试验,连续传代培养10代,观察其生长情况并测定GABA含量,结果如表5所示,GABA高产菌株43-7产GABA的量稳定,未出现回复突变;如表6分析结果显示菌株43-7每代的GABA产量无显著变化(p<0.05),说明该菌株均有较好的遗传稳定性。

表5 GABA高产菌株43-7遗传稳定性实验Table 5 High-yield GABA strain 43-7 genetic stability experiment

表6 菌株43-7遗传实验方差分析Table 6 Variance analysis of genetic testing for strain 43-7

3 结论

本实验以酸马奶样品中分离得到的17株乳酸菌作为供试菌株,通过高效液相色谱法测定其GABA产量,从而筛选出一株产GABA能力较强的菌株,最终选择菌株43为出发菌株,并对其进行生理生化及分子生物学鉴定,将菌株43鉴定为植物乳杆菌。再以该菌为出发菌株进行紫外诱变处理,紫外诱变的最佳条件为30 W的紫外灯下、照射距离为30 cm,照射40 s,经7轮诱变和筛选得到一株高产GABA菌株43-7,其GABA含量为1.051 g/L,比原始菌株产量提高了43.6%,将菌株43-7连续传代10代,每代的GABA产量无明显差异,说明高产GABA菌株43-7遗传稳定性较好。本实验结果为规模化生产功能性食品奠定了基础,也为GABA的发酵生产提供了参考意义。