胀气食醋中污染微生物的 分离鉴定及其生理生化特性

孙文丽,孙 玲,邢 政,侯小珊,何荣海,马海乐

(江苏大学食品与生物工程学院,江苏镇江 212013)

我国是一个食醋生产和消费的大国,食醋作为一种大众化的调味品,在日常生活中已必不可缺。目前欧美等大部分国家的食醋酿造主要为液态深层发酵工艺,通过以醋酸菌为主的纯菌发酵进行,此工艺下食醋有机酸、风味物质单一[1]。而我国主要采用的是多菌种固态发酵工艺酿醋,其在发酵过程中存在大量的微生物,它们共同作用使得固态酿造食醋具有丰富的味觉,其中除了含有大量的有机酸之外,还含有丰富的氨基酸、挥发性物质等,本质上是一个微生物菌种混合发酵的过程。镇江香醋是我国比较有代表性的固态发酵食醋[2-4]。

然而固态发酵在赋予食醋特有风味[5]的同时,易出现食醋返混现象,即在保质期内会在瓶底出现沉淀,瓶口出现浮圈等现象。一般食醋在其货架期内(2～3个月)会出现不同程度的返混[6],这些现象的出现不仅影响食醋的感官、品质,也影响食醋生产企业的效益[7]。目前,固态发酵食醋的返混机理主要归结为非生物性返混和生物性返混[8-9]。非生物性返混常与原料大分子的分解程度、单宁分子、金属离子和氧化酶等因素有关[10]。对于非生物性返混,段连华等[11]、López等[12]已进行相关研究进行改善,选择合适的澄清剂[13]也可以达到一定澄清的效果。而引起食醋生物性返混的主要原因则是杂菌污染,导致食醋杂菌污染的原因主要有以下几点:酿造工艺及酿造过程的开放式,造成微生物的复杂多样性,已知主要有醋酸菌、霉菌、酵母菌、乳酸菌等[14-15],从而使杂菌易进入发酵体系;原料、容器和管道的灭菌不彻底级灌装和存储过程中的管理不善;食醋中丰富的营养物质也有利于芽孢杆菌产生的耐热芽孢,且后续杀菌工艺不能完全杀灭耐热芽孢[16]。崔云等[17]从成品固态发酵食醋中分离出了4种杂菌,分别属于芽孢杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属和葡糖杆菌属,而周翔等[18]也在某固态发酵食醋生产厂中对问题醋进行检测,也检出有芽孢杆菌,说明成品食醋的浑浊、变质可能是由于芽孢杆菌再次发酵引起的。林秀敏等[19]则发现食醋浑浊并非由可培养微生物引起,而可能由非可培养微生物引起的。目前,对于食醋中微生物杂菌污染问题,报道结果并不一致且存在一定的差异;且多数报道并无对污染杂菌进行系统的分离鉴定及生理生化特性研究。然而杂菌污染会对食醋的感官、体态、口感、品质等造成较大影响,不仅影响产品的质量安全,而且还会对食醋生产企业的信誉和形象带来损害。因此,对食醋中的污染杂菌进行研究具有重要意义。

针对目前食醋污染研究不足的问题,本研究主要通过对比分析正常食醋与胀气食醋的生理生化指标,探究污染杂菌对食醋造成的品质影响,对胀气食醋中的污染杂菌进行系统的分离鉴定及生理生化特性研究,为实际生产中控制微生物造成食醋污染提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

正常成品固态发酵食醋与胀气食醋 由某调味品厂提供;培养基 AAM培养基[20]、营养肉汤培养基、MRS培养基、YPD培养基、糖发酵培养基;生理生化鉴定管 购于北京陆桥技术股份有限公司;细菌基因组DNA提取试剂盒 购于康为世纪公司;API试剂条 购于生物梅里埃公司;硫化氢检测管、氨气检测管、氮氧化物检测管、二氧化碳检测管、手泵 购于上海孟良仪器技术有限公司;其他化学药品 均为分析纯产品。

N-300M型光学显微镜 购于南京江南永新光学有限公司；Waters 1525高效液相色谱 购于美国Waters公司；UV-1601型紫外可见分光光度计 购于上海光谱仪器有限公司；T100 PCR仪 购于Biometra公司；DYY-7C电泳仪 购于上海六一仪器厂；LRH-250型恒温培养箱 购于上海恒一科学仪器有限公司；HH-S恒温水浴锅 购于上海医疗器械五厂；YX280A型高压蒸汽灭菌器 购于上海三申医疗器械有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 食醋样品感官指标的对比 参考GB 18187-2000中的方法,对正常成品固态发酵食醋与胀气食醋的色泽、香气、体态进行对比分析。

1.2.2 食醋样品基本理化指标的测定 采用pH计测定食醋样品的pH;根据GB/T 18187-2000对食醋中可溶性固形物、氯化钠含量、可溶性无盐固形物含量进行测定;按GB/T 5009.41-2003对食醋样品的总酸度进行测定;依据GB/T 5009.41-2003测定食醋样品中的氨基态氮含量;根据文献[21]对食醋样品中的还原糖含量进行测定;利用HPLC法对食醋样品中有机酸含量进行的测定。

1.2.3 胀气食醋样品气体成分分析 用手泵收集胀气食醋样品中的气体,分别用硫化氢检测管、氨气检测管、氮氧化物检测管、二氧化碳检测管检测胀桶食醋样品中硫化氢、氨气、氮氧化物、二氧化碳4种气体的浓度,方法参照操作说明书。

1.2.4 菌种的分离、纯化 将胀气食醋逐次稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5不同浓度梯度,用移液枪分别吸取100 μL不同稀释度的污染醋于AAM、营养肉汤、MRS、YPD培养基上,做3个平行,同时用无菌水做空白对照,于37 ℃条件下培养48 h。挑取可以在培养基上生长的主要菌种的单菌落分别分离纯化,对分离得到的单菌落进行简单的结晶紫染色[22],在光学显微镜下观察其纯度和形态,不纯的用划线分离法进行纯化,经镜检纯化的单菌落于4 ℃冰箱中斜面保藏,并于-80 ℃条件下50%甘油保藏。

1.2.5 菌种鉴定 分别对菌株进行菌落形态及显微形态观察、产气与耐热性测定、生理生化鉴定及分子生物学鉴定。

1.2.5.1 菌落形态及显微形态观察 将所得到的菌在培养基上涂布,进行菌落形态观察。选取24 h内新鲜菌进行革兰氏染色[22],涂片不宜过厚,以免脱色不完全造成假阳性。乙醇脱色时间要掌握恰当,一般以不溶出色素为止。紫色为阳性。

1.2.5.2 产气与耐热性测定 将分离菌用液体培养基于37 ℃活化培养24 h,以4%的接种量接种到糖发酵培养基中,内置有杜氏发酵管,注意小倒管中不要有气泡,37 ℃静置培养,观察杜氏小管中有无气泡或絮状物产生。以空白培养基作对照[16]。将镜检已纯化的菌株接种于10 mL无菌水中制成菌悬液,于80 ℃水浴中13 min进行热休克处理[23-24],再采用涂布法接种于平板培养基上，37 ℃培养24 h,观察菌株的生长状态,考察其耐热性。

1.2.5.3 生理生化鉴定 使用生理生化鉴定管和API 50 CHB对菌株进行鉴定。使用生理生化鉴定管对菌株进行氧化酶试验、接触酶试验、VP试验、明胶液化、吲哚试验、尿酶试验等进行鉴定。按照使用说明,利用API 50 CHB鉴定系统对菌株对49种碳源底物的利用能力进行测定。结果分析时,以0号管为对照,比0号管颜色黄的判读为阳性反应(25号管黑色为阳性反应),反之为阴性反应。

1.2.5.4 分子生物学鉴定 a. DNA的提取:将分离菌种接种在液体AAM培养基中,37 ℃,180 r/min摇床培养24 h,用细菌通用基因组DNA提取试剂盒按步骤提取菌株DNA。

b. PCR扩增:扩增的上游引物为27F,下游引物为1541R。

PCR扩增的反应体系为:2×Es Taq MasterMix 12.5 μL,模板DNA 0.5 μL,PrimerF(10 μmol/L)1 μL,PrimerR(10 μmol/L)1 μL,ddH2O 10 μL。

PCR反应条件:95 ℃预变性5 min后进入循环,95 ℃变性0.5 min,55 ℃退火0.5 min,72 ℃延伸1.5 min,29个循环,之后72 ℃终延伸10 min,4 ℃保藏。

c. PCR产物检测:采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。本试验的点样量为5 μL DNA 样品+loading buffer(0.25%的溴酚兰蔗糖水溶液)。同时在其中一个胶孔内点入5 μL的Marker作为对照,以便确定DNA片段的大小。

d. DNA序列的测定:将PCR扩增产物寄往北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。测序结果在NCBI上进行BLAST比对,构建各菌株系统发育树。

1.2.6 生长特性的研究 生长曲线的测定:将分离得到菌分别接入灭菌的AAM液体培养基中,37 ℃,180 r/min恒温摇床培养。前10 h每小时取样一次,之后每2 h取样一次测各菌株培养液的吸光值,以未接种的空白AAM液体培养基为参比,利用分光光度计测定600 nm处的吸光度。根据检测结果,绘制各菌株在37 ℃下的生长曲线。

1.3 数据统计分析

食醋样品理化指标、顶隙气体成分分析、菌株生理生化等实验每个样品重复测定3次,数值计算利用Excel软件进行平均值与方差的计算。

2 结果与分析

2.1 食醋感官指标分析

正常食醋与胀气食醋的感官指标对比分析如表1所示。分析正常食醋和胀气食醋样品的感官指标发现,胀气组发生明显的胀气现象,食醋颜色深于正常组,典型的醋香味不明显,酸味刺鼻且有轻微焦糖味,且胀气食醋伴随有较多沉淀现象。

表1 食醋感官指标分析Table 1 Analysis of sensory index of vinger

2.2 食醋样品理化指标结果分析

分别对正常组和胀气组样品的pH、可溶性固形物含量、氯化钠含量、可溶性无盐固形物含量、总酸度、还原糖、氨基态氮含量、有机酸含量等进行测定,结果见表2。分别以有机酸的峰面积为纵坐标,有机酸含量为横坐标,绘制标准曲线,从而建立各有机酸的回归方程,结果见表3,有机酸含量结果见表4。由结果可知胀气组pH略高于正常组,总固形物含量约为正常组的1.6倍,远远高于正常组食醋,氯化钠、还原糖含量两组差异不大,总酸度胀桶组约为正常组的1.5倍,氨基态氮含量,胀气组远远高于正常组。这表明,食醋发生胀气,其理化性质会发生一系列改变,这与胀气食醋中存在的微生物有关。由有机酸、糖分及氨基酸等组分对传统酿造食醋的味感起主要作用,其中有机酸是主要的风味物质,有机酸的种类和含量与食醋的口感及品质有紧密联系。从结果来看,正常组和胀气组食醋的有机酸构成中,乙酸含量均为最高,其次为乳酸。乳酸和乙酸共同构成食醋的主体有机酸,为食醋的主要呈酸物质。对比正常食醋与胀气食醋中各有机酸含量发现,胀气食醋中各有机酸含量均有不同程度的增长,这主要与胀气食醋中存在污染微生物有关。

表2 样品理化性质分析Table 2 Analysis of samples physical and chemical properties

表3 各种有机酸标准溶液的回归方程及相关系数Table 3 Regression equations and correlation coefficients of organic acids

表4 食醋有机酸含量(mg/100 mL)Table 4 Content of each organic acid in vinegar samples(mg/100 mL)

2.3 胀气食醋样品气体成分分析

分别用4种检测管检测胀气食醋样品中的气体成分,结果见表5。在微生物的生长代谢过程中,可以通过三羧酸循环、糖代谢等一系列的代谢反应产生二氧化碳气体,检测结果显示氨气、

表5 胀气食醋成分分析(%)Table 5 Analysis of gas composition in pollution vinegar(%)

氢气、硫化氢气体均未检出,而二氧化碳含量高于1.1%,已知空气中二氧化碳含量约为0.04%[16],胀气食醋中二氧化碳浓度远远高于空气中浓度,说明胀气食醋中主要气体成分为二氧化碳,由微生物代谢产生。

2.4 污染杂菌的确定

从污染食醋中经过分离、筛选、纯化,最终在AAM培养基上分离得到2株污染杂菌,即分离菌1号、4号。在营养肉汤培养基上得到了4株污染杂菌,即分离菌RT-1、RT-2、RT-3、RT-4。6株菌的形态描述如表6所示。

表6 菌株形态学特征Table 6 Morphological characteristics of strains

2.5 菌种鉴定

2.5.1 分离菌形态学鉴定 简单的革兰氏染色后,经显微观察,分离菌的显微形态如图1所示。

图1 菌株显微形态观察Fig.1 Results of micro-morphology 注:1.1号;2.4号;3.RT-1;4.RT-2;5.RT-3;6.RT-4。

经染色观察发现,6株分离菌均为G+,菌落形态如图1所示。其中1号菌、4号菌、RT1、RT4经芽孢染色[25]后发现均能够生成芽孢,具体种属确定还需要进一步进行鉴定。

2.5.2 产气与耐热性鉴定 将分离菌接种到糖发酵培养基中,培养24 h后观察产气情况,产气与沉淀情况如表7所示。结果可知,4号菌具有产气能力,其余分离菌均可产生一定量的絮状物沉淀,其中1号菌絮状物沉淀较多,因此对1号菌和4号菌做进一步的生理生化鉴定。

表7 食醋产气与沉淀分析Table 7 Analysis of gas production and precipitation in vinegar

分离菌1号和4号经过80 ℃、水浴13 min 进行热休克处理后,均可以在AAM培养基上生长,表明在食醋生产最后经过高温浓缩过程依然不能将污染杂菌除去,从而造成食醋的后期污染;另外分离杂菌可以在酸性AAM培养基上生长良好,表明两株菌均可以在食醋酸性条件下生长良好,酸性环境并不能对污染菌造成抑制;以上分析初步确定了分离菌1号和4号为食醋中的污染杂菌。

2.5.3 生理生化鉴定 分离菌1号、4号的生理生化试验结果如表8所示。结果表明1号菌,氧化酶试验、接触酶试验、VP试验、吲哚试验为阳性,明胶液化试验、尿素酶试验为阴性。4号菌氧化酶试验、VP试验为阳性,接触酶试验、明胶液化试验、吲哚试验、尿素酶试验为阴性。分离菌1号和4号的碳源利用情况如表9所示,结果显示,1号菌和4号菌的碳源利用情况一致。鉴定结果与试剂盒提供的芽孢杆菌属的糖利用情况基本一致,其中仅10半乳糖、17肌醇、19山梨醇、33菊糖利用不同,剩余45种糖的利用情况完全一致。初步猜测这种差异应该是同菌属不同菌种之间表现出来的差异性,初步推测这两株菌为芽孢杆菌属,具体种还需要进一步鉴定。

表8 各菌株生理生化反应分析Table 8 Results of physiological characteristics

表9 各菌株碳源利用特征Table 9 Carbon source utilization characteristics of each strain

2.5.4 PCR产物电泳图 PCR扩增产物纯化的电泳图如图2所示。

图2 1号、4号、RT1、RT2、RT3、 RT4 DNA的PCR产物电泳图Fig.2 PCR products electrophoresis of No.1,No.4,RT1,RT2,RT3,RT4

由图2可知，6株菌的DNA经PCR扩增后，条带大小约在1500 bp左右，且均只有一条亮带，说明基因扩增成功。

2.5.5 分子生物学鉴定结果 分别对6株分离菌构建菌株发育树,如图3所示。16S rDNA测序分析结果可知,6株菌1号、4号、RT1、RT2、RT3、RT3、RT4分别与Bacillusvelezensis、Bacillustequilensis、Bacillusvelezensis、Staphylococcussaprophyticus、Staphylococcuscapitis、Bacillusstubtilis的相似度均达到98%及以上。因此,初步认为分离菌1号、RT1为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis),4号菌为特基拉芽孢杆菌(Bacillustequilensis),RT2为腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、RT3为头状葡萄球菌(Staphylococcuscapitis)、RT4为枯草芽孢杆菌(Bacillusstubtilis)。

2.6 生长特性研究结果

分离菌1号菌和4号菌的生长曲线如图4所示。从图中可以看出,1号菌的迟缓期较短,约从第2 h开始进入对数期,第9 h OD值达到最高,之后OD值下降约从第11 h进入稳定期。4号菌约从第3 h进入对数期,菌体浓度在第7 h达到最大值,之后OD值下降,从第11 h进入稳定期。

图4 分离菌的生长曲线Fig.4 Growth curve of isolated strain

3 结论

通过分析正常食醋与胀桶食醋样品的理化性质,可知胀气食醋中总酸、可溶性无盐固形物含量、氨基酸态氮含量升高;各有机酸含量明显升高;且胀气组食醋明显深于正常组、沉淀含量高于正常组。污染微生物利用食醋中的糖类化合物进行生长代谢,产生二氧化碳导致食醋发生胀桶现象。通过分离纯化,从胀气食醋中分离得到6株菌,且分离菌均能产生沉淀,其中两株产生絮状物沉淀较多,是导致食醋发生粘稠的主要原因。其中一株可产气,是导致食醋发生胀桶的主要污染微生物。食醋胀桶对食醋品质产生不利影响,对产厂商造成经济损失。因此,要注意食醋生产过程的卫生情况,包括生产用水、用料的安全把控。同时注意对食醋成品的杀菌情况做好控制,多次煮沸会对食醋品质造成一定程度的损害,近年来非热杀菌引起了人们的重视,其对食品的风味、色泽及营养成分损失较少,因此,开发采用非热杀菌方式成为预防食醋污染的新挑战,是我们下一步的主要研究方向。