灯盏花素注射液对急性脑缺血/再灌注损伤模型大鼠凝血功能及脑血管内皮功能的影响*

朱爱萍 王 丽 李 清△

（1.湖北省十堰市太和医院，湖北医药学院附属医院，湖北 十堰 442000；2.湖北省十堰市人民医院，湖北 十堰 442000）

灯盏花素注射液是从菊科植物短葶飞蓬、灯盏花全株中提取分离所得的黄酮类有效成分，具有抗血栓形成、抗凝血、抗心肌缺血，改善微循环及血液流变性、增加脑血流量、提高机体耐缺氧能力等作用［1］。临床用于治疗脑出血所致后遗症、脑供血不足、脑血栓、高黏脂血症、心绞痛、冠心病等疾病［2］。有研究表明其可通过促进血管新生、清除自由基而发挥急性脑缺血/再灌注损伤的保护作用［3］。但在针对急性脑缺血/再灌注可能因凝血功能异常而发生如出血倾向、血栓形成或弥散性血管内凝血（DIC）等引起的血管内皮损伤，以及与调节血管内皮依赖性舒张功能相关因子如一氧化氮（NO）释放及内皮型一氧化氮合酶（eNOs）基因表达等方面鲜有相关实验研究，本研究系统观察了灯盏花素注射液对MCAO模型大鼠上述指标的影响，分析其如何通过凝血酶激活途径影响凝血功能，以及其对NO释放及eNOs基因表达的影响，揭示其调节血管内皮功能、保护脑内皮免受上述因素造成的损伤机制，以期为临床用药提供理论依据。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SD大鼠60只，雄性，SBF级，体质量180～190 g，实验动物由湖北医药学院实验动物中心提供［许可证：SCXK（鄂）2017-0008］。

1.2 药物与试剂 灯盏花素注射液（石药银湖制药有限公司， 批号：Z17021942）；NO、eNOs检测 ELISA 试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，批号：H17023，H1724）；TXA2、t-PA及PAI试剂盒（上海酶联生物科技有限公司，批号：0173h40，0173h44，17006）；PGI2 检测试剂盒（上海信裕生物科技有限公司量，批号16049）；TT、Xa和凝血酶活性荧光定量检测试剂盒 （上海杰美基因医药科技有限，批号：E0722，E17110，E1627）。

1.3 造模与分组 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠（按3.0 mL/kg剂量麻醉），注射水合氯醛后约5 min，针刺足底检查麻醉效果，当翻正反射及疼痛均消失时即可开始手术。大鼠取仰卧位，固定大鼠门齿，剃去颈胸部鼠毛后消毒，纵行切开颈正中皮肤（约2 cm），钝性分离皮下组织和肌肉，暴露左侧颈总动脉，沿颈总动脉血管纵行钝性分离出颈内动脉及颈外动脉。结扎颈外动脉血管后剪断，并用高频电凝电刀夹闭血管止血，沿颈内动脉向远心端分离出进入颅内的翼腭动脉，在颈内动脉近心端下置一根手术线，然后分别用微动脉夹夹闭翼腭动脉远心端和颈内动脉近心端，在紧靠颈内动脉近心端备用手术线处用眼科剪剪一小口，取用0.9%氯化钠注射液浸泡的备用栓线小心插入，当栓线到达翼腭动脉微动脉夹夹闭处时，松开微动脉夹，缓慢推进到标记处，当手感遇到阻力即可。此时栓线已到达willis环，不可再用力，否则可能刺破willis环造成蛛网膜下腔出血，栓线阻断供血90 min后抽出以恢复大脑血流。分层缝合颈部皮下组织和肌肉、消毒。待大鼠清醒后，参照Longa 5级4分制神经学评分进行评分，评分在1~4分的大鼠为造成功。其中0分：为正常体征，大鼠清醒后未出现异常的神经系统体征。1分：提起大鼠时右侧上肢不能完全伸展。2分：提起大鼠时右前爪内收并握紧爪子，行走时向右侧旋转。3分：行走时向对侧完全倾倒，动物不能正常行走。分组：术后12 h，剔除造模后死亡及蛛网膜下腔出血的24只。选择经Longa神经学评分符合急性脑缺血/再灌注损伤标准的36只成模大鼠，随机均分为对照组、叶酸组和灯盏花素组。

1.4 给药方法 各组均从尾静脉注射给药治疗14 d（均每日1次），其中对照组按每只大鼠0.2 mL注射0.9%氯化钠注射液，叶酸组按每只大鼠1 mg注射叶酸注射液，灯盏花素组按每只大鼠1 mg注射灯盏花素注射液。

1.5 标本采集及检测 1）治疗第14日，采用Longa神经学评分比较治疗前后3组神经功能恢复情况。2）剪断大鼠尾部（约2 mm），迅速取500 μL静脉血低温冻存备用；断尾取血后同时记录BT及CT时间。BT采用断尾法记录：断尾取血用滤纸每15 s吸符尾尖溢出之血液，至出血停止时间即为BT时间。CT时间采用玻片法：在检测BT的同时，用滤纸吸去第1滴血，将鼠尾静脉血滴到玻片上（直径约5 mm），间隔15 s用大头针从边缘向内侧轻挑1次，以出现纤维蛋白丝为CT时间。3）BT及CT时间记录完后，断头法处死大鼠，迅速取开颅，小心录取脑组织，分离出脑缺血区组织，采用HE染色法检测病理学改变。4）取willis动脉，采用发色底物法检测willis动脉环内皮组织t-PA及PAI活性。5）采用固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）检测大鼠willis动脉环NO、eNOs及血浆PGI2含量；采用放射免疫法测定TXA2含量。6）取低温冻存备用的静脉血，采用凝血因子生成实验观察大鼠静脉血内/外源性凝血因子Xa活性。7）采用发色底物法测定血浆凝血酶含量及TT。

1.6 统计学处理 应用SPSS12.0统计软件。计量资料以（±s）表示，对于经方差分析符合正态分布的采用t检验，方差不齐采用校正t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs 水平比较 见表1。与对照组比较，叶酸组NO及eNOs水平均显示提高，两组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。叶酸对 Tt-PAT、PGI2、TXA2、PAI水平无明显影响，故叶酸组 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI水平与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。灯盏花素组t-PAT活性和PGI2含量提高，而TXA2含量、PAI活性、内/外源性凝血因子Xa和凝血酶含量均降低，与对照组和叶酸组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表 1 各组 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs比较（±s）

表 1 各组 t-PAT、PGI2、TXA2、PAI、NO 及 eNOs比较（±s）

与对照组比较，*P＜0.05；与叶酸组比较，△P＜0.05。 下同

组 别 n t-PAT（IU/mL）PGI2（ng/mL）PAI（IU/mL）TXA2（ng/L）NO（ng/mL）eNOs（pg/mL）对照组 12叶酸组 12 1.69±0.54 56.37±7.25 12.59±2.31 1.73±0.48 58.24±6.51 12.05±2.73 197.54±12.76 194.28±20.14 8.14±0.79* 6.27±0.53*19.24±2.05*△ 10.86±1.03*△灯盏花素组 122.86±0.75*△ 80.50±7.29*△ 8.94±0.92*△130.57±16.69*△18.28±2.72△ 9.69±0.91△

2.2 各组凝血功能比较 见表2。叶酸对内/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成、CT、TT及BT均无明显影响，与对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。灯盏花素内/外源性凝血因子Xa、凝血酶生成减少，CT、TT及BT延长，与对照组和叶酸组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 各组治疗前后Longa神经学评分比较 见表3。治疗前后对照组Longa神经学评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）。叶酸组Longa神经学评分明显降低，与治疗前和对照组比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。灯盏花素组Longa神经学评分显著降低，与对照组、叶酸组和治疗前比较差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表2 各组凝血功能比较（±s）

表2 各组凝血功能比较（±s）

组 别 n CT（s） BT（s） TT（s） 凝血酶（U）内源性凝血因子 Xa（pg/mL）外源性凝血因子 Xa（pg/mL）对照组 12叶酸组 12 81.27±7.34 402.97±59.81 179.29±20.13 82.07±9.69 406.25±60.34 181.04±19.67 15.36±2.71 16.73±1.95 80.97±10.81 79.34±6.57 82.23±7.96 77.85±6.26灯盏花素组 12102.48±19.55*△ 549.29±47.58*△ 221.97±26.55*△11.58±2.80*△67.34±6.01*△ 63.54±7.81*△

表3 各组治疗前后Longa神经学评分比较（分，±s）

表3 各组治疗前后Longa神经学评分比较（分，±s）

与本组治疗前比较，#P＜0.05；与对照组治疗后，*P＜0.05；与叶酸组治疗后比较，△P＜0.05

组 别 n 治疗前 治疗后对照组 12 4.27±0.35 4.41±0.27叶酸组 12 4.23±0.37 2.96±0.21*#灯盏花素组 12 4.30±0.31 1.85±0.16*△#

2.4 各组脑组织病理检查结果 见图1。脑缺区HE染色显示，对照组脑缺区可见神经细胞排列紊乱、胞核溶合，出现坏死灶。叶酸组HE染色未见坏死灶，但有少量神经细胞排列紊乱、胞核溶合现象较对照组明显少。灯盏花素组细胞排列紊乱及溶合现象较对照组明显好转且优于叶酸组。

图1 各组脑组织病理学检查结果（HE染色，400倍）

3 讨 论

血管活性物质NO为机体重要的舒血管因子，可通过血管内皮细胞自分泌、内分泌和旁分泌等不同途径分泌，参与调节血管紧张性、对血栓形成、平滑肌细胞增殖、动脉粥样硬化、白细胞黏附及血管壁炎症反应均具有抑制作用［4］。NO主要由激活的eNOs催化产生，故两者存在着正反馈调节机制，eNOs活性增强可崔化NO合成与释放，而NO增多有利于抑制血管内皮细胞活化和血小板聚集［5］。NO在缺血/再灌注中发挥着双重调节机制，NO释放减少会导致血管内皮依赖性舒张功能降低，从而增加脑梗死及缺血性脑卒中的发生，而NO释放过多又会引起平滑肌细胞过度增殖及血小板的黏附降低，这会增加脑出血的发生风险［6］。由此可见，NO在脑梗死或脑出血的病理过程中均发挥着重要作用，而调节eNOs基因表达在维持血管内皮功能方面具有重要的研究价值。脑缺血/再灌注损伤是急性脑血管病发生与发展的重要病理生理基础，会影响到纤溶系统的激活通路，包括促凝活性增强、抗凝活性减弱。脑研究表明，急性脑缺血/再灌注损伤是造成颅脑损伤的重要诱因，而颅脑损伤可引起如DIC等凝血功能紊乱等凝血功能异常现象，这也是造成颅脑损伤者死亡的主因［7］。因DIC的出血及血栓栓塞常引起广泛的血管内皮损伤引，其造成的多器官功能障碍综合征将导致患者死亡，故防止DIC，保护血管内皮在防治心脑血管性疾病方面具有重要意义。机体凝血功能由多因素参与，其中血小板微粒体中前列腺素H2经血栓素A合酶的催化下产生TXA2合成，TXA2释放后可激活血小板并使其聚集，具有强烈促进血管收缩作用，在组织损伤时可减轻炎症反应、促进创伤愈合［8］。PGI2也是由血管壁内皮细胞合成和释放，具有舒张血管及抗血小板聚集的生物活性，在炎症反应中可产生炎性疼痛［9］。在生理状态下，组织或血浆或PGI2和TXA2保持动态平衡，当其平衡失调（PGI2生成减少或TXA2合成增多）均可能导致血小板聚集、血管出现痉挛收缩，这是血栓形成根本原因之一［10］。因此，测定PGI2和TXA2在血浆或组织中的浓度对临床血栓性疾病的发病预测及疗效判断均具有重要的意义［11］。t-PA是一种丝氨酸蛋白酶，可以将纤溶蛋白酶原转化为纤溶蛋白酶，从而促进纤维蛋白溶解，t-PA由血管内皮细胞合成、分泌的一种单链糖蛋白，对纤维蛋白有高度亲和力，在释放入血液后将酪氨酸纤溶酶原全成为纤溶酶、从而降解纤维蛋白原和凝血因子［12］。因此，提高t-PA活性、降低PAI活性或增加PGI2生成均可改善血管内皮功能，调节机体凝血与纤溶功能［13］。

叶酸注射液为强力血管保护剂，可增强eNOs活性，刺激血管内皮细胞合成和释放NO，增强血管舒张功能［14］。在本研究中作为阳性对照，其可显著提高eNOs活性并促进血管内皮细胞合成和释放NO，叶酸组NO、eNOs均较对照显著升高。而灯盏花素注射液也具有叶酸促进eNOs和NO的功能，灯盏花素组NO、eNOs均显著升高。另外，灯盏花素注射液还可提高t-PAT活性和PGI2含量、降低TXA2合成、抑制PAI活性的作用。在治疗14 d后，灯盏花素组t-PAT活性和PGI2含量提高，而TXA2含量和PAI活性明显降低，与对照组和叶酸组比较差异有统计学意义。灯盏花素组CT、TT和BT较对照组和叶酸组延长，内/外源性凝血因子Xa和凝血酶含量降低，对凝血功能产生明显的影响。

以上观察结果表明，灯盏花素注射液可能通过提高eNOs活性来促进内皮细胞合成NO，再通过NO发挥扩血管效应，这一作用与血管保护剂叶酸极其相似。另外，灯盏花素对损伤组织凝血功能也产生明显的影响，其机制与抑制PAI活性、提高t-PAT活性并促进PGI2生成、使内/外源性凝血因子Xa和凝血酶生成减少有关。灯盏花素可降低TXA2合成，使血小板激活及聚集受到抑制而不能发挥促血管收缩作用，可降低血栓产生的风险，这一作用的直按结果是延长CT、TT及BT时间。这与苏延玲等［15-16］研究结果高度一致。

综上所述，灯盏花素注射液具有保护急性脑缺血/再灌注损伤模型大鼠脑血管内皮细胞功能、防止凝血功能紊乱的作用。经脑区HE染色还发现灯盏花素注射液对急性脑缺血/再灌注损伤模型大鼠脑缺区神经细胞具有保护作用，灯盏花素组细胞排列紊乱及溶合现象较对照组明显好转且优于叶酸组，在改善Longa神经学评分方面较叶酸强，说明灯盏花素注射液具有改善脑损伤神经功能的作用。从以上观察结果来看，灯盏花素注射液的抑凝血效应明显，这对减少急性脑缺血/再灌注后血栓形成产生积极的作用，在临床治疗急性脑梗死后，降低血栓形成、保护血管内皮方面产生了积极的治疗作用。